Estudo da expressão das proteínas cromodomínio-helicase e SET/TAF-Iβ durante o processo de estrobilização de Mesocestoides corti

Abstract

A cromodomínio-helicase (CHD) e a SET/TAF-Iβ (chaperona de histonas) são proteínas conhecidas por estarem envolvidas em processos de remodelagem de cromatina e controle da expressão gênica. Em organismos como Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, camundongo e o homem, estas proteínas estão associadas ao controle de vários processos de desenvolvimento. Em Mesocestoides corti, um modelo de parasito cestódeo, sequências relacionadas à CHD e à SET/TAF-Iβ foram identificadas em uma seleção de genes diferencialmente expressos em larvas e vermes estrobilizados. Visando à identificação de marcadores moleculares de processos e estágios de desenvolvimento da Classe Cestoda, os padrões de expressão de ortólogos das proteínas CHD e SET/TAF-Iβ (McCHD e McSET/TAF) em M. corti foram investigados. Inicialmente as sequências codificadoras da McCHD e McSET/TAF foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli para produção de proteínas recombinantes. Análises por imunoblot e imuno-histoquímica foram realizadas utilizando anticorpos gerados contra versões recombinantes das proteínas-alvo do estudo. Foram analisados quatro estágios de desenvolvimento de M. corti: larvas (tetratirídeos, TT), TT após 24h de indução ao processo de estrobilização (o qual confere o desenvolvimento da larva em adulto) (24h-Ind), TT após 72h de indução (72h-PI) e vermes estrobilizados (VE). Em imunoblots, a McCHD apresentou altos níveis de expressão em três estágios de desenvolvimento de M. corti: TT, 72h-PI e VE, sendo detectado um menor nível de expressão no estágio 24h-Ind quando comparado aos demais. Já a McSET/TAF apresentou um aumento gradual no seu nível de expressão após a indução (nos estágios de 24h-Ind, 72h-PI e VE), não sendo detectada em TT. Em secções longitudinais foram observados um maior nível de expressão da McCHD em estágios iniciais de desenvolvimento (TT e 24- Ind) enquanto que McSET/TAF foi observado um maior nível de expressão nos estágios intermediários e no final do desenvolvimento de M. corti. Para ambas as proteínas a localização foi citoplasmática e não houve diferenças de distribuição nos tecidos analisados. Para compreender melhor as diferenças encontradas nos níveis de expressão das proteínas, análises por PCR em tempo real (RT-qPCR) foram realizadas para quantificação dos níveis de transcritos dos genes McCHD e McSET/TAF. Foram encontradas diferenças significativas nos níveis de expressão gênica de McCHD e McSET/TAF somente em dois estágios: o inicial (TT) e o adulto (VE), conforme análises pelo teste de Duncan. Níveis maiores de expressão gênica de ambos os genes foram encontrados no último estágio de desenvolvimento (VE) de M. corti. A caracterização de genes e proteínas envolvidas no processo de estrobilização de platelmintos da classe Cestoda contribuirá para o melhor entendimento de rotas do desenvolvimento de cestódeos, podendo auxiliar também na determinação de novos alvos terapêuticos para o tratamento de cestodíases.

Chromodomain-helicase (CHD) and the SET/TAF-Iβ histone chaperone are proteins known to be implicated in processes of chromatin remodeling and regulation of gene expression associated with the control of developmental processes in different organisms, such as Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, mouse and human. In Mesocestoides corti, a model cestode parasite, CHD and SET/TAF-Iβ related sequences were isolated in a screening for genes differentially expressed in larvae (tetrathyridia) and adult worms. Aiming at identifying molecular markers of processes and stages of development of Class Cestoda, the expression patterns of M. corti CHD and SET/TAF-Iβ orthologous proteins (McCHD and McSET/TAF) were investigated. Initially, the coding sequences of McCHD and McSET/TAF were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production. Analysis by immunoblotting and immunohistochemistry was performed using antibodies raised against recombinant versions of the proteins target the study. We analyzed four developmental stages of M. corti: bona fide tetrathyridia (TT), tetrathyridia 24 h after strobilation induction (24h-Ind), strobilating worms 72 h after induction (72h-PI), and fully strobilated worms (VE). Immunoblots showed high levels of expression McCHD in three developmental stages of M. corti: TT, 72h-PI e VE, and detected a lower level of expression in stage 24-Ind in comparison to others. The McSET/TAF showed a gradual increase in their level of expression after induction (stages of 24h-Ind, 72h- PI e VE) was not detected in TT. In longitudinal sections were observed an increased level of expression of McCHD in early stages of development (TT and 24-Ind) while McSET/TAF there was a higher level of expression in the intermediate and late stages of development of M. corti. Both McCHD and McSET/TAF showed a cytoplasmic location and a uniform pattern of immunostaining, no differences in distribution between the tissues. For a better understanding the differences in levels of protein expression, analysis by real-time PCR (RT-qPCR) was performed to quantify the transcript levels of genes McCHD and McSET/TAF. There were significant differences in levels of gene expression McCHD and McSET/TAF only in two stages: the initial (TT) and adult (VE), as analysis by Duncan test. Higher levels of gene expression of both genes were found in the last stage of development (VE) of M. corti. The characterization of genes and proteins involved in the process of strobilation flatworms of the class Cestoda contribute to a better understanding of the development of cestodes routes and may also assist in the determination of new therapeutic targets for the treatment of cestodiasis.