Expressão de fatores de transcrição recombinantes de Mycoplasma hyopneumoniae

Abstract

Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido com alto conteúdo de A+T e ausência de parede celular. Este organismo é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, uma doença crônica que afeta rebanhos em todo mundo sendo responsável por grandes perdas econômicas. Para investigar a patogênese de M. hyopneumoniae é importante entender seus mecanismos genéticos, porém, apesar do sequenciamento do genoma de várias linhagens (7448, J, 232 e 168), pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam e controlam a expressão gênica neste microrganismo, principalmente no que se relaciona às proteínas regulatórias. Os fatores de transcrição são proteínas que se ligam ao DNA e propiciam a capacidade de controlar a expressão gênica sob diferentes estímulos metabólicos ou condições de crescimento. O conhecimento que se tem sobre essas proteínas em M. hyopneumoniae é escasso, então, desta forma, este trabalho tem como objetivo a análise de potencias fatores de transcrição de M. hyopneumoniae. Para isso foram selecionadas proteínas tradicionalmente descritas em bancos de dados como fatores de transcrição (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; e a proteína hipotética MHP7448_0551), além de uma proteína hipotética que apresenta similaridades estruturais com fatores sigma (MHP7448_0639). Estas proteínas foram clonadas por recombinação homóloga in vivo no vetor de expressão pGEX 4T1 e transformadas em Escherichia coli para expressão das proteínas recombinantes. Porém, para empregar essa técnica foi necessário realizar a mutagênese sítio-dirigida para a substituição do códon UGA (triptofano em micoplasmas) para UGG (triptofano no código genético universal) nas proteínas que apresentavam este códon. As mutações foram inseridas através da técnica de overlap extension PCR, utilizando primers mutagênicos. Foram obtidos clones para três proteínas (MHP7448_0551, MHP7448_0639 e MHP7448_0010), que foram eficientemente expressas em E. coli. Depois de solubilizadas com 0,5% de sarcosil, essas proteínas foram submetidas a um processo de purificação por cromatografia de afinidade. A purificação foi bem sucedida para duas das três proteínas testadas, e novos testes serão realizados com a proteína ainda não purificada (MHP7448_0010). Uma vez purificados, os potenciais fatores de transcrição serão utilizados na identificação das regiões do DNA que essas proteínas regulam e que estão envolvidas no controle da expressão gênica em M. hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a reduced genome with a high A+T content and no cell wall. This bacterium is the etiological agent of swine enzootic pneumonia, a chronic disease that affects herds throughout the world and is responsible for great economic losses. To investigate the pathogenesis of M. hyopneumoniae it is important to understand their genetic mechanisms, however, despite the genome sequencing of several strains (7448, J, 232 and 168), little is known about the mechanisms that regulate and control the gene expression in this bacterium, especially about regulatory proteins. Transcription factors are proteins that bind to DNA providing the ability to control gene expression under different metabolic stimuli or growth conditions. The knowledge about these proteins in M. hyopneumoniae is scarce; therefore, the aim of this study is the analysis of potential transcription factors of M. hyopneumoniae. We selected proteins traditionally reported in databases as transcriptional factors (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; and the hypothetical protein MHP7448_0551), and a hypothetical protein which has structural similarities with sigma factors (MHP7448_0639). These proteins were cloned by in vivo homologous recombination in the expression vector pGEX 4T1 and were transformed into Escherichia coli to express the recombinant proteins. Nevertheless, for the application of this system it was necessary to perform site-directed mutagenesis to replace the codon UGA (tryptophan in mycoplasma) to UGG (tryptophan in the universal genetic code) in the proteins that presented this codon. The mutations were introduced by overlap extension PCR technique, using mutagenic primers. Clones were obtained for three proteins (MHP7448_0551, MHP7448_0639 and MHP7448_0010), which were efficiently expressed in E. coli. After solubilization with 0.5% sarkosyl, these proteins were subjected to purification by affinity chromatography. Purification was successful for two of the three tested proteins, and further tests will be carried out with the protein not purifyed (MHP7448_0010). After purification, the potential transcription factors will be used to identify the regions of DNA that these proteins regulate and which are involved in the control of gene expression in M. hyopneumoniae.