Identificação e análise de expressão de microRNAS em soja sob estresse biótico e abiótico

Abstract

Seca e ferrugem asiática da soja (FAS) são dois dentre os principais estresses abióticos e bióticos que afetam negativamente a produtividade da soja (Glycine max L. Merrill) no mundo inteiro. A base genética da tolerância à seca e da resistência à FAS não são bem conhecidas e esclarecer como ocorre a resposta a estes estresses em soja é ainda um desafio. Atualmente, sabe-se que as plantas adaptam-se a estes estresses por meio da regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional. Na via da regulação pós-transcricional, microRNAs (miRNAs) têm sido apontados como importantes reguladores em várias plantas sob estresse biótico e abiótico. Entretanto, em soja, não havia sido relatado qualquer miRNA responsivo a estas condições. Neste contexto, nosso objetivo foi identificar novos miRNAs em soja e, também, caracterizar o padrão de expressão de alguns destes miRNAs durante ambos os estresses, além de buscar detectar genes alvos para estes miRNAs. Deste modo, esta tese foi dividida em capítulos, os quais apresentam os diferentes trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. No capítulo III estão relatados os resultados da primeira investigação sobre a adequação de miRNAs como genes normalizadores em plantas. A estabilidade da expressão dos miRNAs foi investigada em diferentes tecidos e genótipos de soja, bem como entre estresses biótico e abiótico. Ao final deste trabalho, foram mostradas evidências de que a estabilidade da expressão de miRNAs pode ser maior que a de genes codificadores de proteínas em análises de RT-qPCR. No capítulo IV está descrita a descoberta de novos miRNAs a partir de bibliotecas de deficiência hídrica e FAS em soja, pelo emprego de sequenciamento de alto desempenho (Solexa). Neste estudo, foram detectados 256 miRNAs. Análises de RT-qPCR foram realizadas para alguns dos novos miRNAs, observando-se alguns miRNAs diferencialmente expressos, indicando evidência molecular para um possível envolvimento de miRNAs em processos responsivos à deficiência hídrica e FAS. Para um dos miRNAs detectado, um novo alvo foi validado, correspondendo a um gene codificador de ascorbato oxidase e possivelmente relacionado com a infecção pelo fungo da ferrugem asiática em genótipo suscetível, dados estes apresentados no capítulo V. Esta tese contribui para o aumento de informações sobre miRNAs de plantas, bem como para o entendimento da regulação gênica em soja sob estresses de deficiência hídrica e FAS.

Drought and Asian Soybean Rust (ASR) are the major abiotic and biotic stresses that negatively affect soybean (Glycine max L. Merrill) productivity around the world. The genetic basis of drought tolerance and ASR resistance are not well understood, and clarification on how the response to these stresses occur in soybean is still a challenge. Currently, it is known that adaptation is achieved through the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. In the way of post-transcriptional regulation, microRNAs (miRNAs) have been found to act as key regulator factors in many other plants under biotic and abiotic stresses. However, in soybean there was no report of miRNAs responsive to these conditions. In this context, our goal was to identify new miRNAs in soybean, characterize some of the miRNA expression patterns during both stresses, and try to detect target genes for the miRNAs. In this way, this thesis was divided in chapters which present the different works that were developed during the PhD period. In chapter three, the suitability of miRNAs as housekeeping genes in plants was investigated. MiRNA expression stability was analysed in different soybean tissues and genotypes as well as after abiotic or biotic stress treatments. It was shown that miRNA expression stability can be higher than the expression stability of protein-coding genes by RT-qPCR analysis. In chapter four, new miRNAs were discovered from Solexa deep sequencing of soybeans submitted to water deficit and rust infection. From these analyses 256 miRNAs were detected. RT-qPCRs were performed for some of the new miRNAs and the identification of differentially expressed miRNAs was observed, provinding molecular evidence for the possible involvement of miRNAs in the process of water deficit- and rust-stress responses. For one of the new miRNAs detected by Solexa sequencing, a new target was validated, which is a gene encoding ascorbate oxidase and that seems to be related with soybean rust infection in the genotype susceptible to the fungus (results were presented in chapter five). The present thesis contributes to improve the information about miRNAs in plantas, as well as to the understanding of soybean gene regulation under water deficit and ASR stresses.