Co-expressão das subunidades EgB8/2 e EgB8/3 do antígeno B de Echinococcus granulosus em E. coli

Abstract

O estágio larval do Echinococcus granulosus é o agente etiológico da hidatidose. O antígeno B (AgB) é um dos principais componentes antigênicos do liquído hidático do metacestódeo e foi caracterizado como uma lipoproteína imunogêncica de 120-160 kDa. Na presença de agentes redutores, dissocia-se em 8, 16, 24 e 32 kDa, sugerindo que é composto de multímeros de subunidades de 8 kDa. Embora a função biológica do AgB ainda não seja totalmente clara, muitos estudos demonstraram sua atuação junto à processos importantes na relação parasito-hospedeiro, por exemplo, a evasão da resposta imune do hospedeiro. Nosso laboratório já clonou e expressou em Escherichia coli cinco cDNAs que codificam subunidades do AgB, EgB8/1, EgB8/2 e EgB8/3, EgB8/4 e EgB8/5. Um trabalho recente realizado em nosso laboratório demonstrou que as subunidades recombinantes do AgB, rAgB8/1, rAgB8/2 e rAgB8/3, são capazes de autoassociarem em solução formando homo-oligômeros com características estruturais semelhantes ao AgB nativo. Entretanto, neste trabalho não foi testada a heterooligomerização das subunidades recombinantes do AgB, visto que as proteínas recombinantes purificadas foram obtidas já sob a forma de homo-oligômeros, não sendo possível a mistura destas subunidades para este fim. Este trabalho tem como objetivo investigar a possível hetero-oligomerização das subunidades recombinantes do AgB através de experimentos de co-expressão. As sequências codificadoras do AgB (EgB8/2) e (EgB8/3) de E. granulosus foram amplificadas por PCR e os produtos de PCR de ambas as sequências foram clonados no vetor de expressão (pCDF-Duet), o qual possui duas regiões com múltiplos sítios de clonagem (MCS). A fidelidade das sequências clondadas foi confirmada por sequenciamento de DNA. As proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli e pela copurificação em coluna de níquel, foi possível verificar experimentalmente que as subunidades rAgB8/2 e rAgB8/3 estão interagindo entre si. A interação entre as subunidades foi confirmada pela análise por imunoblot e espectrometria de massas. Nossos resultados demostram a hetero-oligomerização das subunidades recombinantes rAgB8/2 e rAgB8/3 de E. granulosus e os dados podem fornecer um possível mecanismo de regulação na oligomerização destas subunidades. É necessário um melhor entendimento da estrutura e dos mecanismos de oligomerização do AgB para usá-lo como um importante alvo na elaboração de novas estratégias de prevenção, controle e tratamento de cestodíases.

The larval stage of Echinococcus granulosus is the etiologic agent of hydatidosis. Antigen B (AgB) is a major protein component of the metacestode hydatid fluid and was characterized as a immunogenic lipoprotein of 120-160 kDa. In presence of reducing agents, dissociates into 8, 16, 24 and 32 kDa, suggesting that their consists of multimers of 8kDa subunits. Although the biological function of AgB is still not entirely clear, numerous studies have demonstrated it engagement in important processes in the host-parasite relationship such as evasion of host immune response. Our laboratory has already cloned and expressed five cDNA encode EgB8/1, EgB8/2 e EgB8/3, EgB8/4 e EgB8/5 antigen B subunits in E. coli. Previous studies from our group demonstrated that recombinant AgB subunits are able to self-associate in solution to form homo-oligomers, presenting similar properties to native AgB. However the hetero-oligomerization of the recombinant AgB subunits were not investigated. Since purified recombinant proteins were already obtained in the form of homo-oligomers and, it was not possible to combine these subunits for this purpose. In this work we aim to investigate the possible hetero-oligomerization of the AgB subunits through co-expression experiments. The cDNA sequences enconding E. granulosus EgAgB8/2 and EgAgB8/3 by PCR and the PCR products of both sequences have been cloned in the expression vector (pCDF-Duet), which has two multiple cloning site (MCS). The fidelity of the cloned sequences was confirmed by DNA sequencing. Afterwards the recombinant proteins rAgB8/2 and rAgB8/3 expressed in Escherichia coli. By co-purification in the nickel column, it was possible to verify experimentally that the two subunits rAgB8/2 and rAgB8/3 are interacting one each other. The interaction between the subunits was confirmed by immunoblotting and mass spectrometry. Our results demonstrated the heterooligomerization of recombinant subunits rAgB8/2 and rAgB8/3 of E. granulosus and these data may help to elucidate a possible mechanism for regulation of the subunits oligomerization process. A better understanding of the structure and mechanisms of oligomerization is necessary since that the AgB as an important target in the development of new strategies for prevention, control and treatment of cestodiasis.