Propriedasdes antifúngicas da urease de Canavalia ensiformis

Abstract

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Essas proteínas têm atividade inseticida e fungicida, efeitos independentes da sua atividade ureolítica. A atividade inseticida de ureases depende, em parte, da liberação de peptídeos internos através da hidrólise por catepsinas digestivas do inseto. Um desses peptídeos foi isolado e um recombinante chamado Jaburetox –V5 foi produzido em E. coli a partir da sequência da urease. Outra propriedade relevante de ureases é sua atividade antifúngica, que ocorre em concentrações de 10-7 M para certos fungos filamentosos, causando danos à membrana celular, visualizados por microscopia eletrônica de varredura. Moléculas antifúngicas de origem vegetal representam uma alternativa estratégica para o surgimento de espécies resistentes de fungos. Sabendo que a atividade antifúngica das ureases é cerca de 3-4 de magnitude mais ativa do que a maioria das proteínas antifúngicas já descritas, neste trabalho, avaliamos o efeito tóxico da urease de C. ensiformis (JBU) sobre diferentes espécies de leveduras. Além disso, buscamos identificar as regiões responsáveis por essa atividade através da fragmentação da JBU por hidrólise enzimática. Os efeitos tóxicos da JBU também ocorrem em espécies de leveduras, indicando que atividade antifúngica não afeta somente fungos filamentosos. Os efeitos da JBU nas leveduras variam conforme o gênero e a espécie, tanto em termos qualitativos como quantitativos, indicando seletividade espécie-específica. Os efeitos fungitóxicos consistem de inibição da multiplicação, indução de alterações morfológicas com formação de pseudo-hifas, alterações do transporte de H+ e no metabolismo energético, permeabilização de membranas, podendo ocorrer morte celular. Nas condições testadas, não houve produção de espécies reativas de oxigênio associada ao efeito fungitóxico da JBU. A hidrólise da JBU com papaína produziu fragmentos tóxicos com massa molecular ~10 kD. Esses hidrolisados foram analisados por espectrometria de massas e um fragmento contendo parte da sequência N-terminal do peptídeo entomotóxico Jaburetox foi encontrado. A atividade fungitóxica do peptídeo recombinante Jaburetox – V5 foi testada, sendo observada atividade tóxica sobre leveduras e fungos filamentosos. A atividade antifúngica do Jaburetox-V5 requer concentrações 2-3 vezes maiores do que aquela observada para a holoproteína JBU, indicando a possibilidade de que outros domínios da proteína estejam envolvidos nessa atividade. A descoberta de novos agentes antifúngicos é urgente e imperativa, devido ao crescente número de casos de micoses invasivas. Ureases de plantas, como a JBU, e peptídeos derivados, podem representar uma nova alternativa para controle de fungos de importância clínica e fitopatogênicos, principalmente em se considerando a potente atividade, na faixa de 10-6 a 10-7 M . Estudos estrutura versus atividade adicionais, aprofundando a identificação de domínios antifúngicos, e a construção de recombinantes contendo esses domínios, são etapas futuras para avaliar o real potencial fungicida/fungistático das ureases e peptídeos derivados.

Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These proteins have insecticidal and fungicidal effects not related to their enzyme activity. The insecticidal activity of urease is mostly dependent on the release of internal peptides consequent to hydrolysis of the ingested protein by insect digestive cathepsins. One of these peptides was isolated and its recombinant version, named Jaburetox-V5, was produced in E. coli. Another important property of ureases is their antifungal activity, which occurs at concentrations of 10-7 M for certain filamentous fungi, causing damage to the cell membranes, as visualized by scanning electron microscopy. Antifungal molecules from plants represent an alternative strategy to the emergence of resistant fungal species. Considering that the antifungal activity of urease is about 3-4 orders of magnitude more potent than most of the antifungal proteins already described, in this study, we evaluated the toxic effect of Canavalia ensiformis urease (JBU) on different species of yeast. Furthermore, studies aiming to identify antifungal domain(s) of JBU by enzymatic hydrolysis were carried out. The results showed that JBU exerts toxic effects on yeast species, indicating that antifungal activity is not restricted to filamentous fungi. The effects of JBU in yeast varied according to the genus and species of yeasts, both in qualitative and quantitative terms, indicating a species-specific selectivity. The fungitoxic effects consisted in inhibition of proliferation, induction of morphological alterations with formation of pseudo hyphae, changes in the transport of H+ and carbohydrate metabolism, permeabilization of membranes, eventually leading to cell death. Under the conditions tested, there was no production of reactive oxygen species associated with the antifungal effect of JBU. Hydrolysis of JBU with papain resulted in fungitoxic fragments with molecular mass ~ 10 kD. These peptides were analyzed by mass spectrometry, revealing the presence of a fragment containing the Nterminal sequence of the entomotoxic peptide Jaburetox. We tested the recombinant peptide Jaburetox-V5 for antifungal effects and observed fungitoxic activity on yeast and filamentous fungi. The antifungal activity of Jaburetox-V5 requires 2-3 times larger concentrations than those observed for the holoprotein JBU, indicating the possibility that other protein domains are involved in this activity. The discovery of new antifungal agents is imperative to face the increasing number of cases of invasive mycoses. Plant ureases, such as JBU, and its derived peptides, may represent a new alternative to control medically important and phytopathogenic fungi, especially considering their potent activity in the range of 10-6 to 10-7 M. More studies are necessary to clarify the structure versus activity relationships of ureases. Construction of mutants containing ureasederived antifungal domains is one of the necessary steps to assess the real fungicidal/ fungistatic potential of ureases and derived peptides.