Clonagem, caracterização e expressão de genes envolvidos na síntese de compostos isoprenóides em Eucalyptus grandis

Abstract

Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos.

Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.