Avaliação da PCR digital para identificação e quantificação de Enterobacterales e genes de resistência a carbapenêmicos (blaKPC ou blaNDM) na urina

Abstract

Base teórica: O aumento de isolados de Enterobacterales resistentes a carbapenêmicos (CRE) tornou-se uma séria ameaça à saúde pública global, sendo que as CRE são responsáveis por um número crescente de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS). A rápida identificação de patógenos e de genes de resistência aos cabapenêmicos, como blaKPC e blaNDM, por métodos independentes de cultura, é um aspecto muito importante diante da crescente prevalência de CRE. O avanço das técnicas moleculares tem revolucionado o diagnóstico dessas infecções, sendo a PCR Digital (dPCR) uma nova e promissora abordagem. Objetivo: Avaliar a concordância da técnica de PCR Digital (dPCR) diretamente em amostras de urina para a detecção de Enterobacterales e os genes de resistência blaKPC e blaNDM em comparação aos métodos tradicionais de cultura. Métodos: As análises foram realizadas utilizando o sistema QuantStudio Absolute Q Digital PCR System (ThermoFisher), com ensaio multiplex com primers e sonda TaqMan para detecção e quantificação de Enterobacterales, blaKPC, blaNDM além de RNAse P como controle interno. O DNA bacteriano foi extraído diretamente da urina com o kit Culture Cell DNA Kit (Promega), utilizando o equipamento Maxwell® RSC. O exame bacteriológico foi feito conforme técnica convencional e os isolados bacterianos oriundos da cultura foram avaliados para a presença de blaKPC, blaNDM por qPCR HRM. Resultados: A dPCR foi aplicada a 112 amostras de urina, detectando Enterobacterales em 83,03% (n= 93) e pelo menos um dos genes de resistência (blaKPC ou blaNDM ) em 75,26% (n=70). A quantificação e identificação do Enterobacterales por dPCR apresentou sensibilidade de 75,27%, especificidade de 94,74% e acurácia de 78,57% em comparação com a cultura bacteriológica. Os resultados quantitativos apresentaram forte correlação com as contagens bacterianas observadas na urocultura, corroborando seu potencial para interpretação diagnóstica quantitativa. Para os genes de carbapenemase blaKPC e blaNDM, a dPCR apresentou sensibilidade de 94,74% e 97,87%, e especificidade de 98,18% e 100%, respectivamente. Conclusão: Este estudo demonstrou que a dPCR pode ser uma ferramenta muito útil para a detecção rápida de Enterobacterales e de genes de carbapenemase diretamente de amostras de urina, apresentando excelente desempenho diagnóstico para blaKPC e blaNDM. A técnica representa uma alternativa independente de cultura bastante promissora, capaz de acelerar o diagnóstico e apoiar uma tomada de decisão clínica mais precisa no manejo de infecções urinárias causadas por bactérias resistentes.

Background: The increase in carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) isolates has become a serious global public health threat, as CRE are responsible for a growing number of healthcare-associated infections (HAIs). Rapid identification of pathogens and carbapenem resistance genes, such as blaKPC and blaNDM, using culture-independent methods is highly important given the rising prevalence of CRE. Advances in molecular techniques have revolutionized the diagnosis of these infections, with Digital PCR (dPCR) emerging as a novel and promising approach. Objective: To evaluate the agreement of Digital PCR (dPCR) performed directly on urine samples for the detection of Enterobacterales and the resistance genes blaKPC and blaNDM in comparison with traditional culture methods. Methods: Analyses were performed using the QuantStudio Absolute Q Digital PCR System (ThermoFisher) with a multiplex assay employing TaqMan primers and probe for the detection and quantification of Enterobacterales, blaKPC, blaNDM, and RNase P as an internal control. Bacterial DNA was extracted directly from urine using the Culture Cell DNA Kit (Promega) on the Maxwell® RSC instrument. Bacteriological examination was performed according to conventional techniques, and bacterial isolates recovered from culture were assessed for the presence of blaKPC and blaNDM by HRM qPCR. Results: dPCR was applied to 112 urine samples, detecting Enterobacterales in 83.03% (n = 93) and at least one resistance gene (blaKPC or blaNDM) in 75.26% (n = 70). Quantification and identification of Enterobacterales by dPCR showed a sensitivity of 75.27%, specificity of 94.74%, and accuracy of 78.57% compared with bacteriological culture. Quantitative results showed strong correlation with bacterial counts observed in urine culture, supporting its potential for quantitative diagnostic interpretation. For the carbapenemase genes blaKPC and blaNDM, dPCR showed sensitivities of 94.74% and 97.87%, and specificities of 98.18% and 100%, respectively. Conclusion: This study demonstrated that dPCR can be a highly useful tool for the rapid detection of Enterobacterales and carbapenemase genes directly from urine samples, showing excellent diagnostic performance for blaKPC and blaNDM. The technique represents a highly promising culture-independent alternative capable of accelerating diagnosis and supporting more precise clinical decision-making in the management of urinary infections caused by resistant bacteria.