Expressão e funcionalidade do receptor P2X7 em linhagem de glioma de camundongo GL261

Abstract

O nucleotídeo de purina ATP, no meio extracelular, participa de diversos processos fisiológicos e patológicos como vasodilatação/constrição, proliferação, diferenciação, modulação sináptica, dor, inflamação e morte celular. Entre os receptores purinérgicos, o subtipo P2X7 é bem descrito como mediador de processos inflamatórios pela liberação de IL-1β e de morte celular com ativação de caspases. Evidências na literatura apontam para o envolvimento do sistema purinérgico no crescimento e na progressão de glioblastomas. Esses tumores são os mais comuns do SNC e seu alto grau de malignidade deve-se à capacidade de rápida proliferação e invasão no tecido sadio. Considerando a resistência que os glioblastomas apresentam à morte celular induzida por ATP, o objetivo desse trabalho foi investigar a expressão e funcionalidade do receptor citotóxico P2X7 em linhagens de gliomas e suas implicações na biologia tumoral. Entre as linhagens de glioblastomas estudadas, a linhagem de camundongo GL261 apresentou sensibilidade à morte induzida por ATP pela liberação de LDH, incorporação de iodeto de propídio e diminuição da viabilidade mitocondrial. O ATP foi tóxico em concentrações acima de 2 mM, o BzATP foi mais potente que o ATP e o antagonista oATP bloqueou completamente a morte celular. O silenciamento do receptor P2X7, na GL261, por RNA de interferência, também aboliu a morte celular induzida por ATP confirmando o envolvimento desse receptor, embora a formação de poro ainda tenha sido visível nestas células, ainda que diminuída. A morte celular apresentou características necróticas como a ruptura de membrana, a falta de ativação de caspases e a falta de externalização de fosfatidilserina, mas ao mesmo tempo houve encolhimento celular. Além dos efeitos mediados pela sua ativação, o silenciamento do receptor P2X7 na linhagem GL261 diminuiu a adesão e promoveu a migração celular, características de tumores mais invasivos. Em amostras de pacientes com gliomas, foi possível observar que a expressão de P2X7 correlaciona diretamente com a sobrevida dos pacientes. Juntamente com os dados da linhagem silenciada para o P2X7, é possível apontar o receptor P2X7 como uma possível molécula anti-tumoral, cuja redução na expressão diminui a adesão, aumenta a migração, torna a célula resistente à morte induzida por ATP, possivelmente diminuindo, desta forma, a sobrevida de pacientes acometidos por esta doença.

Purines nucleotides, particularly extracellular ATP, participate in diverse physiological and pathological processes such as vasodilatation/constriction, cell proliferation, differentiation, synaptic modulation, inflammation, pain sensation and cell death. Among purinergic receptors, the P2X7 subtype is well described as a mediator of inflammatory processes via IL-1β release and cellular death induced by caspases activation. Evidences in the literature point to the purinergic system involvement in growth and glioblastoma progression. These tumors are the most common in the central nervous system (CNS) and their high grade of malignance is the result of rapid proliferation and invasion abilities. Considering the resistance that glioblastomas show to ATP-induced cell death, the objective of this work was to investigate the expression and function of cytotoxic P2X7 receptor in glioma cell lines and their implications in tumor biology. Among the glioma cell lines, the mouse GL261 was sensitive to ATP-induced cell death with LDH release, iodide incorporation and a decrease in mitochondrial viability. ATP was toxic in concentrations above 2 mM, BzATP was more potent than ATP and the antagonist oATP blocked completely the cell death induced by ATP. P2X7 receptor silencing in GL261 by RNA interference, also abolished ATP-induced cell death, confirming this receptor involvement, although a diminished pore induction was observed. Cellular death had necrotic features like membrane rupture, lack of caspase activation and lack of phosphatidylserine exposure, but at the same time shrinking also occurs. Beyond its activation effects, P2X7 knockdown in GL261 decreased cell adhesion and promoted migration, features common to more invasive tumors. In human glioma samples, P2X7 receptor expression correlated directly with patients‟ survival. Together with data from P2X7-knocked down cell line, it is possible to suggest the P2X7 receptor as an anti-tumoral molecule, whose expression reduction leads to decreased adhesion, increased cell mobility, resistance to ATP-induced cell death, and therefore, decreased patients survival.