Um mundo invisível : como vesículas de membrana extracelular de H. pylori e P. mirabilis podem contribuir no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas

Abstract

O papel de microrganismos urease-positivos, como Proteus mirabilis (PMU) e Helicobacter pylori (HPU), na progressão de doenças neurodegenerativas é pouco conhecido. As ureases são metaloenzimas níquel dependentes, que catalisam a hidrólise da ureia formando NH3 e CO2. No entanto, estas enzimas também podem atuar como fatores de virulência independentes da ação enzimática. Dentre estes efeitos verificou-se ações pró-inflamatórias e neurotóxicas, que poderiam contribuir para doenças neurodegenerativas como Parkinson (DP) ou Alzheimer (DA). Estes patógenos produzem vesículas de membrana extracelular (OMV, Outer Membrane Vesicles), que contém urease e diversos fatores de virulência, que podem contribuir para doenças extra-gástricas, e são capazes de permear a barreira hematoencefálica. O presente estudo explora o potencial pro-inflamatório de OMV oriundas de P. mirabilis (Pm-OMV) e de H. pylori (Hp-OMV) em diferentes modelos celulares. Exploramos a purificação das OMV por meio de diferentes técnicas: exclusão molecular, ultracentrifugação e com o ExoBacteria OMV Isolation Kit. Após caracterização morfológica das vesículas, quantificação proteica e da atividade ureolítica, culturas de células BV-2 (micróglia murina) e SH-SY5Y (neuroblastoma humano) foram tratadas com três concentrações de Pm-OMV ou Hp-OMV, por diferentes períodos. A avaliação da citotoxicidade, viabilidade e apoptose foi feita com o kit Triplex ApoTox-Glo™. A quantificação de ROS e influxo de cálcio foram realizadas com sondas fluorescentes. A determinação dos níveis de marcadores pró-inflamatórios foi realizada por ELISA. Para a análise estatística utilizamos o software GraphPad Prism 6. Demonstrou-se que ambas as OMVs, carregadas com fatores de virulência como LPS, urease e outras proteínas bacterianas, ativam vias de sinalização inflamatória em células BV-2 e SH-SY5Y, resultando na produção das citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e TNF-α, e de espécies reativas de oxigênio (ROs), além de promoverem influxo de cálcio nas células. Os efeitos variaram em magnitude conforme a origem das OMV e o tipo celular. A microglia mostrou-se particularmente sensível à ativação mediada por OMV, reforçando seu papel central na resposta imune do SNC. Os dados obtidos neste estudo sugerem que Pm-OMV e Hp-OMV podem causar (neuro)inflamação e disfunções celulares, e dessa forma contribuir para a patogênese ou progressão de doenças neurodegenerativas como Parkinson (DP) ou Alzheimer (DA).

The role of urease-positive microorganisms, such as Proteus mirabilis and Helicobacter pylori, in the progression of neurodegenerative diseases is poorly understood. Ureases are nickel-dependent metalloenzymes that catalyze the hydrolysis of urea, forming NH3 and CO2. However, these enzymes can also act as virulence factors independent of their enzymatic activity. Among these effects, pro-inflammatory and neurotoxic actions were observed, which could contribute to neurodegenerative diseases such as Parkinson’s (PD) or Alzheimer’s (AD) diseases. These pathogens produce extracellular vesicles (OMV, Outer Membrane Vesicles) that contain urease and various virulence factors, which can contribute to extra-gastric diseases and are capable of permeating the blood-brain barrier. The present study explores the pro-inflammatory potential of OMVs derived from P. mirabilis (Pm-OMV) and H. pylori (Hp-OMV) in different cellular models. We explored the purification of OMVs through various techniques: size-exclusion chromatography, ultracentrifugation, and the ExoBacteria OMV Isolation Kit. After morphological characterization of the vesicles, protein quantification, and ureolytic activity assessment, BV-2 (murine microglia) and SH-SY5Y (human neuroblastoma) cell cultures were treated with three concentrations of Pm-OMV or Hp-OMV for different periods. Cytotoxicity, viability, and apoptosis were assessed using the Triplex ApoTox-Glo™ Kit (Promega). ROS quantification and calcium influx were measured using fluorescent probes. The determination of pro-inflammatory cytokines levels was performed by ELISA. Statistical analysis was carried out using GraphPad Prism 6 software (San Diego, CA, USA). It has been demonstrated that both OMVs, loaded with virulence factors such as LPS, urease, and other bacterial proteins, activate inflammatory signaling pathways in BV-2 and SH-SY5Y cells, resulting in the production of the pro-inflammatory cytokines, IL-1β and TNF-α, and reactive oxygen species (ROS), in addition to promoting calcium influx in the cells. The effects varied in magnitude depending on the OMV origin and cell type. Microglia were particularly sensitive to OMV-mediated activation, reinforcing their central role in the immune response of the CNS. The data obtained in this study suggest that Pm-OMV and Hp-OMV can cause (neuro)inflammation and cellular dysfunctions, thereby contributing to the pathogenesis or progression of neurodegenerative diseases such as PD or AD.