Efeitos da estimulação magnética repetitiva em cultura celular de neuroblastoma e células tumorais não-neuronais

Abstract

Abordagens neuromodulatórias têm sido extensivamente empregadas em condições neurológicas, demonstrando resultados positivos. Dentre os métodos disponíveis, a estimulação magnética transcraniana repetitiva (EMTr) tem sido investigada para o tratamento de transtornos neurológicos. O aumento da utilização de técnicas neuromodulatórias no tratamento de doenças aponta para a necessidade de mais estudos que investiguem os processos celulares e vias moleculares envolvidas nos efeitos destas técnicas, promovendo maior segurança em seu uso em pesquisa pré-clínica e clínica. Desta forma, justifica-se a necessidade de elucidar as vias envolvidas nos processos modulatórios em modelos celulares. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi padronizar um método utilizando um protótipo de estimulador de estimulação magnética repetitiva (EMr) para cultura celular, avaliando propriedades celulares e parâmetros moleculares no processo de tumorigênese após a estimulação. Esta dissertação é composta por 2 estudos. O estudo 1 consiste em uma revisão de escopo, a qual inclui estudos que investigaram os efeitos da estimulação magnética estática (EMe) e EMr em ensaios in vitro e in vivo, com o objetivo de avaliar protocolos e o impacto da estimulação sobre parâmetros morfológicos e moleculares. Foram incluídos nove artigos sobre EMr, dos quais três com ensaios in vitro, dois em modelos animais (in vivo) e quatro analisando resultados em ambos os modelos. Quinze estudos utilizando EMe foram incluídos, dos quais doze in vitro e quatro in vivo. O estudo 2 consiste de um estudo experimental no qual é demonstrada a padronização do método de EMr a partir da utilização de um protótipo de estimulador para cultura celular, avaliando propriedades celulares e parâmetros moleculares no processo de tumorigênese após a estimulação em duas linhagens de células tumorais neurais (SK-N-BE(2) e SH-SY5Y) e uma linhagem de células tumorais não neuronal (HOS), submetidas à exposição diária de EMr por 4 dias. Para investigar seus efeitos, a EMr ativa foi comparada com a EMr simulada. Foram avaliadas a viabilidade celular pelo Teste de Exclusão de Azul de Tripan, a morte celular com coloração de Anexina-V/PI e a expressão gênica de BDNF e NGF, e seus receptores TRKB e TRKA. O estudo 1 demonstrou a complexidade da interação entre campos magnéticos e sistemas biológicos e a necessidade de mais investigações para otimizar protocolos de tratamento, esclarecer mecanismos de ação e validar a segurança e eficácia dos métodos de estimulação magnética. Adicionalmente, indicou que a eficácia das técnicas de estimulação magnética depende de fatores tais como, o tipo e a localização do câncer, o tipo celular e o seu estado metabólico. Parâmetros de exposição como intensidade, frequência e duração da exposição são fundamentais, podendo alterar o sentido dos efeitos obtidos (inibitório vs. estimulatório). Com relação aos dados experimentais, foram observados: redução da viabilidade em células da linhagem SH-SY5Y (0 horas) após EMr por 300 segundos em relação ao grupo de 150 segundos (p absoluto de Dunn = 0,003, p ajustado = 0,020); redução da viabilidade em células da linhagem SK-N-BE(2) (0 horas) após EMr por 300 segundos em comparação ao grupo de 75 segundos (p absoluto de Dunn = 0,010, p ajustado = 0,050). Não houve efeito de EMr na linhagem celular HOS (p > 0,05). Todas as linhagens celulares apresentaram aumento significativo na viabilidade celular 24 horas após o final da estimulação (teste t(8), p < 0,01). Na morte celular das células SK-N-BE(2), não houve diferenças observadas entre os grupos em 0 e 24 horas após o término da exposição com EMr (p > 0,05, para ambos). Houve um aumento nas expressões de BDNF e TRKB (0 horas) em 75 segundos de EMr (4,47 vezes, p < 0,00001 em SHSY-5Y e 2,188 vezes, p < 0,05 em SK-N-Be(2) para BDNF e 13,37 vezes, p < 0,001 em SHSY-5Y e 6,818 vezes, p < 0,0001 em SK-N-Be(2) para TRKB). O nível de BDNF, mas não de TRKB, aumentou após 300 segundos de EMr (2,268 vezes, p < 0,05 em SHSY-5Y e 1,717 vezes, p = 0,12 em SK-N-Be(2). As células SH-SY5Y apresentaram um aumento na expressão de TRKA, 75s e 300s de EMr (0 horas) (4,715 vezes, p < 0,05 e 6,176 vezes, p < 0,01, respectivamente) enquanto SK-N-Be(2) mostrou um aumento nos níveis transcricionais de NGF e TRKA após 75s de EMr (5,561 vezes, p < 0,01 e 1,567 vezes, p < 0,05, respectivamente). O nível transcricional dos receptores TRKB e TRKA diminuiu nas células SH-SY5Y 24 horas após a exposição à EMr, independente do tempo. 24 horas após 75 s de exposição à EMr, os níveis de NGF e TRKA diminuíram nas células SK-N-Be(2) e 24 horas após 300 s de exposição à EMr as células diminuíram os níveis de NGF e TRKB em comparação ao controle (grupo sham). Os resultados obtidos demonstram que o protocolo desenvolvido é reproduzível. Este estudo demonstrou que a EMr é capaz de reduzir agudamente a viabilidade celular e modular a expressão gênica de BDNF e NGF e seus receptores em células de neuroblastoma. Desta forma, é possível sugerir a EMr como uma potencial terapia adjuvante no tratamento de tumores neuronais.

Neuromodulatory approaches have been extensively employed in neurological conditions, demonstrating positive results. Among the available methods, repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) has been investigated for the treatment of neurological disorders. The increased use of neuromodulatory techniques in the treatment of diseases points to the need for more studies investigating the cellular processes and molecular pathways involved in the effects of these techniques, promoting greater safety in their use in preclinical and clinical research. In this way, the need to elucidate the pathways involved in modulatory processes in cellular models is justified. In this context, the aim of this study was to standardize a method using a prototype of repetitive magnetic stimulation (rMS) stimulator for cell culture, evaluating cellular properties and molecular parameters in the process of tumorigenesis after stimulation. This dissertation is composed of 2 studies. Study 1 consists of a scoping review, which includes studies that investigated the effects of static magnetic stimulation (sMS) and rMS in in vitro and in vivo trials, with the aim of evaluating protocols and the impact of stimulation on morphological and molecular parameters. Nine articles on rMS were included, of which three had in vitro trials, two in animal models (in vivo), and four analyzing results in both models. Fifteen studies using sMS were included, of which twelve were in vitro and four in vivo. Study 2 consists of an experimental study in which the standardization of the rMS method is demonstrated thru the use of a stimulator prototype for cell culture, evaluating cellular properties and molecular parameters in the process of tumorigenesis after stimulation in two neural tumor cell lines (SK-N-BE(2) and SH-SY5Y) and one non-neuronal tumor cell line (HOS), subjected to daily rMS exposure for 4 days. To investigate their effects, the active rMS was compared with the simulated rMS. Cell viability was assessed using the Trypan Blue Exclusion Test, cell death with Annexin-V/PI staining, and gene expression of BDNF and NGF, along with their receptors TRKB and TRKA. Study 1 demonstrated the complexity of the interaction between magnetic fields and biological systems and the need for further investigations to optimize treatment protocols, clarify mechanisms of action, and validate the safety and efficacy of magnetic stimulation methods. Additionally, it indicated that the efficacy of magnetic stimulation techniques depends on factors such as the type and location of the cancer, the cell type, and its metabolic state. Exposure parameters such as intensity, frequency, and duration of exposure are fundamental, as they can alter the direction of the obtained effects (inhibitory vs. stimulatory). Regarding the experimental data, the following were observed: a reduction in viability in SH-SY5Y cell line (0 hours) after rMS for 300 seconds compared to the 150-second group (Dunn's absolute p = 0.003, adjusted p = 0.020); a reduction in viability in SK-N-BE(2) cell line (0 hours) after rMS for 300 seconds compared to the 75-second group (Dunn's absolute p = 0.010, adjusted p = 0.050). There was no effect of rMS on the HOS cell line (p > 0.05). All cell lines showed a significant increase in cell viability 24 hours after the end of stimulation (t-test(8), p < 0.01). In the cell death of SK-N-BE(2) cells, no differences were observed between the groups at 0 and 24 hours after the end of rMS exposure (p > 0.05, for both). There was an increase in the expressions of BDNF and TRKB (0 hours) at 75 seconds of rMS (4.47 times, p < 0.00001 in SHSY-5Y and 2.188 times, p < 0.05 in SK-N-BE(2) for BDNF and 13.37 times, p < 0.001 in SHSY-5Y and 6.818 times, p < 0.0001 in SK-N-BE(2) for TRKB). The level of BDNF, but not TRKB, increased after 300 seconds of rMS (2.268 times, p < 0.05 in SHSY-5Y and 1.717 times, p = 0.12 in SK-N-BE(2). The SH-SY5Y cells showed an increase in TRKA expression after 75s and 300s of rMS (0 hours) (4.715 times, p < 0.05 and 6.176 times, p < 0.01, respectively), while SK-N-BE(2) showed an increase in the transcriptional levels of NGF and TRKA after 75s of rMS (5.561 times, p < 0.01 and 1.567 times, p < 0.05, respectively). The transcriptional level of TRKB and TRKA receptors decreased in SH-SY5Y cells 24 hours after rMS exposure, regardless of the time 24 hours after 75s of rMS exposure, the levels of NGF and TRKA decreased in SK-N-BE(2) cells, and 24 hours after 300s of rMS exposure, the cells decreased the levels of NGF and TRKB compared to the control (sham group). The results obtained demonstrate that the developed protocol is reproducible. This study demonstrated that rMS is capable of acutely reducing cell viability and modulating the gene expression of BDNF and NGF and their receptors in neuroblastoma cells. In this way, it is possible to suggest rMS as a potential adjuvant therapy in the treatment of neuronal tumors.