Padronização da técnica de pcr digital para detecção da mutação G12C no gene kras em amostras tumorais

Abstract

Entre as mutações somáticas no gene KRAS, a variante missense c.34G>T no éxon 2 (G12C) é a mais frequente no carcinoma pulmonar de células não pequenas (CPCNP) e a terceira mais frequente em carcinoma colorretal (CCR). Esta variante é alvo de drogas como sotorasibe, tornando sua identificação, por métodos de alta sensibilidade, como a reação em cadeia da polimerase digital (dPCR), fundamental para a medicina de precisão. Este estudo busca avaliar o desempenho analítico da dPCR na detecção da mutação KRAS G12C em amostras tumorais e sua concordância com os resultados obtidos por meio de sequenciamento de nova geração (NGS) e PCR quantitativo (qPCR). O desempenho do teste de dPCR foi avaliado frente ao NGS, métodos de referência. O DNA foi extraído com o kit ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (Promega Corporation, EUA) com posterior dPCR no equipamento QuantStudio Absolute Q Digital PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc, EUA). A avaliação de desempenho analítico demonstrou que os métodos de dPCR e NGS apresentam 100% de concordância e alto grau de correlação em resultados quantitativos. Na avaliação de sensibilidade analítica, a dPCR demonstrou limite de detecção em frequência do alelo mutante (MAF) de 0,5% e se mostrou adequado frente aos ensaios de reprodutibilidade e especificidade analítica. Atendendo, dessa forma, aos requisitos exigidos para validação analítica. A qPCR, por sua vez, apresentou 100% de concordância com o NGS e conseguiu detectar amostras positivas com MAF de até 6,13%. Os resultados sugerem que o dPCR apresenta desempenho satisfatório para a detecção da KRAS G12C em amostras tumorais, e suportam o potencial da metodologia para detecção de mutações somáticas em amostras não-teciduais, como biópsia líquida.

Among somatic mutations in the KRAS gene, the missense variant c.34G>T in exon 2 (G12C) is the most frequent in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and the third most frequent in colorectal cancer (CRC). This variant is targeted by drugs such as sotorasib, making its identification using highly sensitive methods like digital polymerase chain reaction (dPCR) essential for precision medicine. This study aims to evaluate the analytical performance of dPCR in detecting the KRAS G12C mutation in tumor samples and its concordance with results obtained through next-generation sequencing (NGS) and quantitative PCR (qPCR). The performance of the dPCR test was evaluated against NGS, the reference methods. DNA was extracted using the ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (Promega Corporation, USA) followed by dPCR on the QuantStudio Absolute Q Digital PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc, USA). The analytical performance evaluation demonstrated that dPCR and NGS methods showed 100% concordance and a high degree of correlation in quantitative results. In the analytical sensitivity assessment, dPCR showed a limit of detection at a mutant allele frequency (MAF) of 0.5% and proved suitable in reproducibility and analytical specificity tests, meeting the requirements for analytical validation. In turn, qPCR showed 100% concordance with NGS and was able to detect positive samples with a MAF of up to 6.13%. The results suggest that dPCR performs satisfactorily for detecting KRAS G12C in tumor samples and supports the potential of this methodology for detecting somatic mutations in non-tissue samples, such as liquid biopsy.