Secreção de prolactina e proliferação de lactotrofos em resposta a progestogênio, antiestrogênio e agonista da dopamina : desenvolvimento de um modelo experimental de hiperprolactinemia dependente de estrogênio

Abstract

A prolactina (PRL) é um hormônio secretado pela hipófise anterior que exerce múltiplas funções, relacionadas ou não com os processos reprodutivos. Este hormônio é importante no início e manutenção da lactação e modula a ação das gonadotrofinas. Desta forma, modificações na sua secreção, como a hiperprolactinemia, estão associadas com alterações menstruais, galactorréia e infertilidade. Além disso, os prolactinomas são os adenomas hipofisários mais prevalentes e, uma causa relativamente freqüente de hiperprolactinemia. A regulação da secreção de PRL é bastante complexa, envolvendo vários sistemas de neurotransmissores centrais e neuropeptídeos de origem hipotalâmica ou dos lobos hipofisários posterior e intermediário. Os principais estímulos fisiológicos para sua secreção são a sucção, o estresse e o estrogênio. A própria PRL autorregula sua secreção e sofre influências de vários peptídeos que atuam através de mecanismos parácrinos e autócrinos. Diferente de outros hormônios hipofisários, a PRL não é regulada por retroalimentação de hormônios secretados pela glândula alvo, e o controle hipotalâmico é essencialmente inibitório. A dopamina é responsável pela inibição tônica exercida pelo hipotálamo e sua ação pode ser modulada por outros reguladores, principalmente os liberadores, como o estrogênio. O estrogênio é um potente estimulador da secreção de PRL e sua administração pode induzir adenomas hipofisários dependendo da dose, duração do tratamento, espécie e suscetibilidade da cepa. A bromocriptina (BCP) é um agonista dopaminérgico bastante eficiente em reduzir a hiperprolactinemia e o tamanho de tumores hipofisários secretores de PRL, tanto clínica como experimentalmente. Considerando que os estrogênios induzem hiperprolactinemia, têm sido investigados os efeitos sobre a secreção de PRL de alguns fármacos com ação antiestrogênica, como o tamoxifeno e os progestogênios. O tamoxifeno (TAM) é um inibidor competitivo do receptor estrogênico, enquanto os progestogênios atuam diminuindo os receptores estrogênicos e/ou estimulando a enzima conversora de estradiol em estrona. Existe um grande número de modelos experimentais para o estudo da regulação da secreção de PRL, dependendo dos parâmetros avaliados. O estímulo da função e proliferação lactotróficas através da administração de estrogênios é um desses modelos, embora não haja uma padronização quanto aos fármacos, às doses e à duração dos tratamentos utilizados. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo experimental de hiperprolactinemia dependente do estrogênio, avaliando-se níveis de PRL sérica, peso da hipófise e percentual de células imunorreativas à PRL na hipófise de ratas, que receberam vários esquemas de tratamento estrogênico. Após a validação do modelo pela avaliação das variáveis estudadas em resposta à administração de BCP, foram investigados os efeitos de um progestogênio, o acetato de noretisterona (NA), de um antiestrogênio, o tamoxifeno (TAM), e da associação de TAM com NA e BCP, sobre os mesmos parâmetros. Foram utilizadas ratas Wistar adultas, ovariectomizadas e tratadas semanalmente, durante 2, 4 ou 10 semanas, com duas doses de benzoato de estradiol (BE): 50 ou 300 μg/rata (E50 e E300, respectivamente). Associado ao BE também foram administrados, nos últimos 5 ou 12 dias do tratamento estrogênico, BCP (0,05 ou 0,6 mg), NA (0,5 ou 0,1 mg), TAM (20 ou 60 μg) ou TAM combinado com NA e BCP, nas doses mais baixas. Estes fármacos foram administrados diariamente e todas as injeções foram realizadas por via subcutânea. As ratas foram sacrificadas por decapitação, e as hipófises foram removidas imediatamente, pesadas e fixadas em formalina para posterior processamento por imunohistoquímica. O sangue troncular foi coletado, centrifugado e o soro armazenado a -20°C até a dosagem de PRL por radioimunoensaio de duplo anticorpo. As hipófises foram incluídas em parafina e três cortes de cada uma foram corados de acordo com o método da avidina-biotina-peroxidase (HSU et al., 1981 modificado por COUTINHO, 1988). O cromógeno utilizado foi o diaminobenzidina (DAB). Em áreas escolhidas ao acaso foram contadas 200 células nucleadas, registrado o número de células contendo PRL e o resultado foi expresso em percentual de células coradas em relação ao número total de células contadas. Foram determinados os valores de referência para as variáveis estudadas, ou seja, niveis de prolactina sérica, peso da hipófise e percentual de lactotrofos, nos grupos controle. Em relação à PRL sérica e ao peso da hipófise, observou-se que não houve diferença significativa entre os dados obtidos em ratas ovariectomizadas e intactas. Além disso, constatou-se a reprodutibilidade destes resultados. Avaliou-se a variação das concentrações de PRL sérica durante as fases do ciclo estrale, verificou-se que não houve diferença significativa entre as médias da concentração de PRL nas diferentes fases do ciclo, nem em relação às ratas intactas. Os resultados deste trabalho mostram que houve diminuição significativa no percentual de lactotrofos das ratas ovariectomizadas em relação ao número encontrado nas ratas intactas. Estabeleceram-se duas condições de hiperprolactinemia: um estado de hiperprolactinemia "funcional" e outro, com hiperprolactinemia associada a aumento do peso hipofisário e proliferação de lactotrofos. A administração da dose maior de BE (E300) promoveu alterações proliferativas na hipófise, enquanto a dose menor (E50) gerou hiperprolactinemia "funcional". Este modelo experimental foi validado com a reprodução dos efeitos antiprolactinêmicos e antiproliferativos da BCP. Esses efeitos foram dependentes da dose utilizada. A determinação dos efeitos do NA sobre os mesmos parâmetros demonstrou que os efeitos antiproliferativos foram observados em ratas tratadas com E300 e não nas tratadas com E50. Quanto aos níveis de PRL sérica, a administração de NA (0,5 mg) associado ao tratamento com E50/4 semanas, E300/2 semanas e E300/4 semanas reduziu parcialmente esses níveis. Por outro lado, a associação de NA (0,1 mg) ao tratamento prolongado com E300 (10 semanas) produziu redução significativa da concentração de PRL sérica, mas não induziu alterações proliferativas na hipófise. Estes dados sugerem que o efeito antiprolactinêmico do NA depende de um equilíbrio de doses com o BE, e que a existência de hiperprolactinemia prévia pode ser um fator importante. Para demonstrar redução do peso da hipófise e do percentual de lactotrofos em ratas tratadas com E300, durante 2 e 4 semanas, foi necessária a administração de NA durante 12 dias. A combinação de TAM e NA associada ao tratamento estrogênico prolongado com E300 não modificou os níveis séricos de PRL nem o peso da hipófise. Quanto ao percentual de lactotrofos, a utilização de 20 μg de T AM combinado com NA potencializou o efeito antiproliferativo desses fármacos. Isso ocorreu, possivelmente, devido à diferença entre os mecanismos de ação do TAM e do NA. Também foi avaliado o efeito da associação de TAM e BCP e verificou-se que essa associação não alterou significativamente o peso hipofisário e o percentual de lactotrofos. Em relação aos níveis séricos de PRL, o TAM parece ter bloqueado o efeito antiprolactinêmico da BCP. Neste caso, o TAM poderia ter agido como agonista estrogênico antagonizando os efeitos dopaminérgicos. Esta hipótese não foi testada neste trabalho. Os dados do presente trabalho enfatizam a importância da interação estrogênio/antiestrogênio na expressão da hiperprolactinemia. Estudos posteriores poderão definir melhor a função dos antiestrogênios, os mecanismos moleculares através dos quais atuam em estados hiperprolactinêmicos e sua relação com a dopamina e seus agonistas, e/ou com os progestogênios. Além disso, o modelo experimental desenvolvido neste trabalho permite investigar mais profundamente as interações dos estrogênios com outros reguladores da secreção da PRL, como dopamina, progestogênios, e vários neurotransmissores e/ou neuromoduladores sabidamente importantes nessa regulação.

Prolactin (PRL) is an anterior pituitary hormone that fulfills multiple functions, related or not to reproductive processes. It modulates gonadotropin action and is important for the onset and maintenance of lactation. Therefore, substantial changes in PRL levels, such as hyperprolactinemia, are related to menstrual disorders, galactorrhea and infertility. ln addition, prolactinomas are the most prevalent hypophyseal adenomas and a fairly common cause of hyperprolactinemia. The regulation of PRL secretion is quite complex, and involves a great number of central neurotransmitters and neuropeptides from the hypothalamus and from the posterior and intermediate hypophyseal lobes. The main physiological stimuli to its secretion are suckling, stress and estrogen. PRL release is also influenced by a number of peptides which act through paracrine and autocrine mechanisms, as well as by an autoregulatory feedback. Unlike other pituitary hormones, PRL is not regulated by feedback from target gland hormones, and its hypothalamic control is essentially inhibitory. The tonic inhibition exerted by the hypothalamus is imputable to dopamine, whose action can be modulated by other substances, like estrogen. Estrogen acts as a potent stimulator of PRL release and its administration may induce pituitary adenomas depending on dose, treatment duration, species and strain susceptibility. Bromocriptine (BCP), a dopaminergic agonist, is highly effective in reducing hyperprolactinemia, as well as the size of PRL-secreting pituitary tumors, both clinically and experimentally. Since estrogens induce hyperprolactinemia, the effects of some antiestrogenic substances - like tamoxifen and progestins - on PRL secretion have been throughly investigated. Tamoxifen (TAM) is a competitive inhibitor for the estrogen receptor, while progestins act by decreasing estrogen receptors and/or stimulating the enzyme that converts estradiol into estrone. There are many experimental models for studying the regulation of PRL secretion which can be chosen according to the parameters to be assessed. One of these models is the stimulation of lactotroph function and proliferation by estrogen administration, even though the drug, dosage and treatment length have not been standardized to date. The present study aims to develop an experimental model of estrogen-dependent hyperprolactinemia by assessing serum PRL levels, pituitary weight and percentage of PRL immunoreactive cells in the pituitary gland of female rats undergoing several estrogen treatment schedules. After validation of the model through evaluation of the BCP effects on the studied variables, the effects of norethisterone acetate (NA), a progestin, tamoxifen (TAM), an antiestrogen, and the association of TAM with NA and BCP were investigated under the same parameters. Ovariectomized Wistar female rats were weekly treated for 2, 4 or 10 weeks with two subcutaneous doses of estradiol benzoate (EB): 50 or 300 μg/rat (E50 and E300, respectively). ln the last 5 or 12 days of estrogen treatment, BCP (0.05 or 0.6 mg), NA (0.5 or 0.1), TAM (20 or 60 μg) or TAM combined with NA and BCP in the lowest doses, were daily administered in subcutaneous injections. Rats were sacrificed by decapitation and their pituitaries were immediately dissected out to be weighed and fixed in formalin for posterior immunohistochemical processing. Trunk blood samples were collected and centrifuged, and the serum stored at -20°C until assayed for PRL by a double-antibody radioimmunoassay. The pituitaries were included in paraffin and three sections of each specimen were stained according to the avidin-biotin peroxidase method (HSU et al., 1981, modified by COUTINHO, 1988). Diaminobenzidine (DAB) was used as the chromogen. ln areas chosen at random, 200 nucleated cells were counted, the number of cells containing PRL was recorded and the result was expressed as the percentage of stained cells relative to total number of counted cells. Reference values for the variables studied were established, namely, serum prolactin leveis, pituitary weight and percentage of PRL immunoreactive cells in the control groups. As regards serum PRL levels and pituitary weight, no significant difference was observed between data obtained from ovariectomized and from intact rats. ln addition, the reproducibility of these results was established. Also, the oscillation of serum PRL levels through the estrous cycle was assessed, and no significant difference was observed between mean PRL levels in the different phases of the cycle. The results also showed a significant decrease in the percentage of lactotrophs in ovariectomized rats as compared to the number detected in intact rats. Two conditions of hyperprolactinemia were established: "functional" hyperprolactinemia and hyperprolactinemia associated with increased pituitary weight and lactotroph proliferation. The administration of the highest dose of BE (E300) induced proliferative alterations in the pituitary, whereas the lowest dose (E50) produced "functional" hyperprolactinemia. This experimental model was validated by the replication of the antiprolactinemic and antiproliferative effects of BCP. Such effects were dose-dependent. Determination of NA effects on the same parameters demonstrated that its antiproliferative effects were observed in rats treated with E300 but not in those treated with E50. The administration of NA (0.5 mg) associated with E50 (4 weeks), E300 (2 weeks) and E300 (4 weeks) determined a partial reduction of serum PRL levels. On the other hand, association of a low dose of NA (0.1 mg) with E300 long-term treatment (10 weeks) caused a significant reduction in serum PRL levels, but did not induce proliferative hypophyseal alterations. These effects suggest that the antiprolactinemic effect of NA depends on its balance with BE doses and is influenced by the presence of previous hyperprolactinemia. NA was administered for 12 days in order to demonstrate reduction of pituitary weight and percentage of lactotrophs in rats treated with E300 for 2 and 4 weeks. The combination of TAM and NA associated with prolonged estrogen treatment with E300 did not modify serum PRL leveis or pituitary weight. With regard to lactotroph percentage, the use of 20 μg of TAM combined with NA potentiated the antiproliferative effects of these substances. This may have occurred due to the different mechanisms of action of TAM and NA. The effect of T AM and BCP was also assessed and this association did not significantly alter pituitary weight and lactotroph percentage. As to serum PRL levels, TAM appears to have blocked the antiprolactinemic effect of BCP. ln such instance, TAM may have acted as an estrogen agonist counteracting the dopaminergic effect of BCP. This hypothesis has not been tested in the present work. The present data emphasize the importance of estrogen/antiestrogen interaction in the expression of hyperprolactinemia. Further studies will better define the function of antiestrogens, the molecular mechanisms through which they act in hyperprolactinemic conditions and their connection with dopamine and its agonists, and/or with progestins. Moreover, the experimental model developed herein can serve as a useful tool in the investigation of the interactions between estrogens and dopamine, progestins, and various neurotransmitters and/or neuromodulators well-known as important factors for the regulation of PRL release.