Desenvolvimento, caracterização e avaliação de nanocápsulas contendo nicotina, nornicotina, anatabina e anabasina para o tratamento de lesões do sistema nervoso central

Abstract

A nanotecnologia é uma área de pesquisa inovadora que se desenvolveu ao longo das últimas duas décadas, explorando escalas nanométricas para o desenvolvimento de materiais, produtos e processos novos para diversas áreas, como medicina, cosméticos, indústria de alimentos e nanomaterias. Recentemente, muitas técnicas baseadas em nanotecnologia foram propostas para aprimorar a regeneração de tecidos. Sobretudo, nanopartículas, por apresentarem propriedades interessantes no campo da medicina regenerativa, como excelente biocompatibilidade e a capacidade de aumentar a biodisponibilidade do ativo. Lesões no sistema nervoso central (SNC) apresentam graves consequências, incluindo disfunções neurológicas, incapacidade e até morte. Traumas nessa região podem desencadear inflamação sistêmica, demandas metabólicas elevadas e déficits físicos, cognitivos e emocionais, resultando em perda de independência funcional e redução na qualidade de vida. Lesões cerebrais e na medula espinal são especialmente impactantes, prejudicando atividades diárias, movimento, raciocínio, com efeitos impactantes na qualidade de vida. Devido à versatilidade da nanotecnologia, que possibilita atuação em diferentes patologias, como lesão na medula espinal, a qual não há tratamento com o potencial para reabilitação, primeiramente foi realizada uma revisão bibliográfica para investigar os recentes avanços em nanotecnologia para o tratamento da lesão medular e reparação tecidual. Foi visto que, embora a nanotecnologia seja promissora para o tratamento da lesão medular, os testes em humanos ainda estão em fase teórica. No segundo momento, foi realizada uma revisão bibliográfica abordando métodos convencionais e novas tecnologias de nanoencapsulação, visando determinar o método mais eficaz para encapsular moléculas, especialmente as hidrofílicas, as quais apresentam um desafio significativo. Foi possível concluir que, os métodos mais utilizados para nanoencapsulação são baseados em processos de emulsificação. Diversos estudos forneceram evidências claras de que a nicotina, um alcaloide que constitui o princípio ativo do tabaco, apresenta poderosos efeitos fisiopatológicos no organismo, através de propriedades anti-inflamatórias e neuroprotetoras. Neste contexto, a nornicotina, anatabina e anabasina, análogos da nicotina, também demonstraram essas atividades em estudos recentes. Avaliando as interessantes propriedades da nicotina e seus análogos, um sistema nanoestruturado provavelmente iria potencializar seus efeitos benéficos bem como reduzir seus efeitos adversos. Na parte experimental desse trabalho, foram produzidas nanocápsulas inovadoras de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) contendo 3mg/mL de nicotina, nornicotina, anatabina ou anabasina, pelo método de deposição interfacial de polímero pré-formado (nanoprecipitação), as quais foram avaliadas quanto ao tamanho de partícula, índice de polidispersidade (PdI), potencial zeta, pH, porcentagem de eficiência de encapsulamento, morfologia, estabilidade e perfil de liberação. Testes in vitro com a linhagem celular PC12 foram realizados, como ensaios MTT, Live/Dead e ELISA, para verificar a citotoxicidade e atividade anti-inflamatória dos nicotinoides. Nesse estudo, foi possível produzir nanocápsulas de PLGA contendo nicotina, nornicotina, anatabina e anabasina, homogêneas e sem a presença de precipitados, com potencial zeta negativo, tamanho submicrométrico e baixo PdI, significando que há homogeneidade na distribuição dos tamanhos das partículas. A eficiência de encapsulação foi de 50,7%, 43,6%, 48,9% e 52,9%, respectivamente, para nicotina, nornicotina, anatabina e anabasina, demonstrando que aproximadamente a metade dos ativos se encontra associada às nanocápsulas. Na avaliação por microscopia eletrônica de transmissão (MET), as nanocápsulas mostraram morfologia esférica, regular e nanométrica, corroborando com os resultados encontrados na análise de tamanho de partícula e PdI. Todas as suspensões se mantiveram estáveis quando estocadas na geladeira, pelo período de 30 dias. Na análise do perfil de liberação, todas as nanocápsulas exibiram liberação inicial rápida, o que é atribuído principalmente ao fármaco ligado ou adsorvido à superfície das nanocápsulas e após, se manteve uma liberação sustentada. Os testes in vitro mostraram que o tratamento com nanocápsulas contendo nicotinoides não reduziu a viabilidade celular, o que indica que tanto as nanocápsulas quanto os nicotinoides não foram tóxicos para as células, nas concentrações avaliadas. No ensaio de ELISA, não foi observada variação na expressão de citocinas em células PC12 tratadas com nicotinoides, possivelmente devido às baixas concentrações utilizadas. Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que as nanocápsulas contendo nicotina, nornicotina, anatabina e anabasina foram satisfatoriamente desenvolvidas e caracterizadas. Ainda, não apresentaram citoxicidade nas concentrações testadas. Portanto, podem ser ferramentas terapêuticas promissoras para o tratamento de lesões do sistema nervoso central.

Nanotechnology is an innovative area of research that has developed over the last two decades, exploiting nanometric scales to develop new materials, products and processes for various areas, such as medicine, cosmetics, the food industry and nanomaterials. Recently, many nanotechnology-based techniques have been proposed to improve tissue regeneration. Nanoparticles in particular have interesting properties in regenerative medicine, such as excellent biocompatibility and the ability to increase drug bioavailability. Injuries to the central nervous system (CNS) have serious consequences, including neurological dysfunction, disability and even death. Trauma to this region can trigger systemic inflammation, high metabolic demands and physical, cognitive and emotional deficits, resulting in loss of functional independence and reduced quality of life. The impact of brain and spinal cord injuries is especially significant, impairing daily activities, movement and reasoning and adversely affecting the quality of life. Due to the versatility of nanotechnology, which makes it possible to act on different pathologies, such as spinal cord injury, for which there is no treatment with the potential for rehabilitation, a bibliographical review was first carried out to investigate recent advances in nanotechnology for the treatment of spinal cord injury and tissue repair. It was found that although nanotechnology is promising for the treatment of spinal cord injury, tests on humans are still in the theoretical phase. The second stage involved a literature review of conventional methods and new nanoencapsulation technologies, with the aim of determining the most effective method for encapsulating molecules, especially hydrophilic ones, which present a significant challenge. It has been concluded that the most widely used methods for nanoencapsulation are based on emulsification processes. Several studies have provided clear evidence that nicotine, an alkaloid that is the active ingredient in tobacco, has powerful pathophysiological effects on the body, through anti-inflammatory and neuroprotective properties. Within this context, nornicotine, anatabine, and anabasine, nicotine analogs, have also demonstrated these activities in recent studies. Given the interesting properties of nicotine and its analogs, a nanostructured system would probably enhance their beneficial effects and reduce their adverse effects. In the experimental part of this work, innovative poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanocapsules containing 3mg/mL of nicotine, nornicotine, anatabine, or anabasine were produced using the interfacial deposition method of a pre-formed polymer (nanoprecipitation), and were evaluated for particle size, polydispersity index (PdI), zeta potential, pH, encapsulation efficiency percentage, morphology, stability, and release profile. In vitro tests with the PC12 cell line were carried out, such as MTT, Live/Dead, and ELISA assays, to verify the cytotoxicity and anti-inflammatory activity of nicotinoids. In this study, it was possible to produce PLGA nanocapsules containing nicotine, nornicotine, anatabine and anabasine, which were homogeneous and without the presence of precipitates, with negative zeta potential, submicrometric size and low PdI, meaning that there is homogeneity in the particle size distribution. The encapsulation efficiency was 50.7%, 43.6%, 48.9% and 52.9% for nicotine, nornicotine, anatabine and anabasine, respectively, demonstrating that approximately half of the active ingredients are associated with the nanocapsules. In the TEM evaluation, the nanocapsules showed spherical, regular and nanometric morphology, corroborating the results found in the particle size and PdI analysis. All the suspensions remained stable when stored in the refrigerator for a period of 30 days. In the analysis of the release profile, all the nanocapsules exhibited rapid initial release, which is mainly attributed to the drug bound or adsorbed to the surface of the nanocapsules; following this, a sustained release was maintained. The in vitro tests showed that treatment with nanocapsules containing nicotinoids did not reduce cell viability, indicating that both the nanocapsules and the nicotinoids were not toxic to the cells at the concentrations assessed. In the ELISA assay, no variation in cytokine expression was observed in the PC12 cells treated with nicotinoids, possibly due to the low concentrations used. The results obtained in this study show that the nanocapsules containing nicotine, nornicotine, anatabine and anabasine were satisfactorily developed and characterized. They also showed no cytotoxicity at the concentrations tested.These nanocapsules could, therefore, be promising therapeutic tools for the treatment of spinal cord injury.