Desenvolvimento de um protocolo de criopreservação seminal de Leiarius marmoratus

Abstract

A presente pesquisa avaliou desenvolver um protocolo de criopreservação espermática de L. marmoratus padronizado para servir tanto na produção de híbridos como na conservação ex situ da espécie. Vinte três machos (n=23) foram distribuídos em quatro experimentos onde amostras de sêmen foram coletadas, criopreservadas e submetidas a análises após seu descongelamento. O primeiro teste verificou qual o crioprotetor permeável juntamente com metodologia de descongelamento apresentou melhor desempenho sobre as amostras seminais da espécie. O segundo experimento, utilizando as melhores amostras do primeiro e segundo teste, verificou a ação de diferentes tempos de permanência em vapor de nitrogênio sobre o material criopreservado. O terceiro experimento verificou qual a concentração do melhor crioprotetor permeável apresenta os melhores resultados após descongelamento. Por fim, o último teste verificou qual o melhor crioprotetor impermeável apresenta melhor desempenho em conjunto ao crioprotetor permeável. As amostras de sêmen foram diluídas no meio testado (1:4), depois congeladas em recipiente com vapor de nitrogênio e armazenadas em nitrogênio líquido a -196°C. Os parâmetros de cinética, avaliados em todos os experimentos, pós-descongelamento foram realizados pelo sistema CASA e os resultados de análise de integridade da membrana (foi realizada no último experimento) foi obtido através de microscopia de fluorescência. Como resultado foi possível observar que: o tempo de 2 horas em vapor de nitrogênio não alterou a qualidade das amostras criopreservadas; as metodologias de 45°C por 5 segundos e 40°C por 8 segundos podem ser empregadas no descongelamento de amostras da espécie; o Metanol sem o uso da combinação de um crioprotetor impermeável, apresentou no geral, os melhores resultados nas análises cinéticas e na integridade de membrana. Assim, os testes in vitro mostraram que o Metanol pode ser empregado na criopreservação seminal de L. marmoratus, podendo ser utilizado no desenvolvimento de um banco de germoplasma ou em sistemas de produção de peixes brasileiros.

The present research evaluated the development of a standardized L. marmoratus sperm cryopreservation protocol to serve both in the production of hybrids and in the ex situ conservation of the species.Twenty three males (n=23) were distributed in four experiments where semen samples were collected, cryopreserved and subjected to analysis after thawing. The first test verified which permeable cryoprotectant together with the thawing methodology performed better on the seminal samples of the species. The second experiment, using the best samples from the first and second tests, verified the action of different residence times in nitrogen vapor on the cryopreserved material. The third experiment verified which concentration of the best cryoprotectant permeable presents the best results after thawing. Finally, the last test verified which the best waterproof cryoprotectant performs best together with the permeable cryoprotectant. The semen samples were diluted in the tested medium (1:4), then frozen in a container with nitrogen vapor and stored in liquid nitrogen at -196°C. The kinetic parameters, evaluated in all experiments, post-thawing wasperformed by the CASA system and the results of membrane integrity analysis (it was performed in the last experiment) were obtained through fluorescence microscopy. As a result, it was possible to observe that: the 2hour period in nitrogen vapor did not change the quality of the cryopreserved samples; the methodologies of 45°Cfor 5 seconds and 40°Cfor 8 seconds can be used to thaw samples of the species; Methanol without the use of a combination of an impermeable cryoprotectant, generally presented the best results in kinetic analyzes and membrane integrity. Thus, in vitro tests showed that Methanol can be used in the seminal cryopreservation of L. marmoratus, and can be used in the development of a germplasm bank or within Brazilian fish production.