Manipulação por engenharia genética do genoma do vírus da febre aftosa para a construção de novos candidatos a vacinas

Abstract

A febre aftosa é uma doença altamente infecciosa dos animais artiodáctilos, mantendo-se como um dos maiores problemas para a saúde do gado em muitos países desenvolvidos e constituindo uma ameaça contínua para os países livres da doença. O agente etiológico desta doença, o vírus da febre aftosa (VFA), pertence ao gênero Aphthovirus da família Picornaviridae. Vacinas convencionais do VFA consistindo do vírus total inativado, tem sido instrumento no controle da doença em muitas partes do mundo. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, tem surgido um grande interesse na produção de vacinas sintéticas. Estas novas vacinas irão eliminar os riscos associados com o isolamento de grandes quantidades de vírus infecciosos e impedir a produção de vacinas inativadas inapropriadamente (BARTELING & VREESWIJK, 1991). Recentemente, tem sido desenvolvido uma nova geração de vacinas baseadas em vírus (re)construídos. O extensivo conhecimento do VFA a nível molecular e a facilidade de manipulação do DNA recombinante, tem levado à produção de clones de cDNA infecciosos do tipo 01 (ZIBERT et al., 1990) e do tipo Al2 (RIEDER et al., 1993), facilitando o desenvolvimento racional de vacinas virais vivas atenuadas. Baseado nestas informações, variantes genéticas do VFA sorotipo Al2 deletadas da região codificadora dos aminoácidos RGD (McKENNA et al., 1995), os quais tem sido implicados no mecanismo de reconhecimento celular, tem sido produzidas. Estes vírus demonstraram ser incapazes de crescerem nas células normais e não foram capazes de causar doença nos animais. Neste trabalho nós descrevemos a construção do vírus quimérico A24 Cruzeiro e a produção de uma variante genética deletada da região codificadora dos aminoácidos RGD (RGD-). Um experimento realizado em suínos para testar a inocuidade deste vírus, demonstrou que o vírus A24 RGD- não foi capaz de ser transmitido para os animais não inoculados, embora uma replicação limitada, mas detectável, foi observada nos suínos inoculados. Os resultados deste experimento nos sugere que este vírus pode ser utilizado como uma fonte segura de antígenos na produção de vacinas virais inativadas quimicamente. Tentativas na produção de vacinas atenuadas para o VFA tem falhado, devido à reversão da sua virulência (BARTELING & VREESWIJK, 1991). Variantes do VF A contendo a deleção da região codificadora da proteinase líder (Al2-LLV2; PICCONE et al., 1995) tem sido produzidas. Este tipo de de vacina não tem a capacidade de reverter e mostrou ser avirulenta em bovinos e suínos. Vírus atenuados dos sorotipos A24 Cruzeiro e 01 Campos também sido produzidos pela deleção da região codificadora da proteinase líder (LL). O vírus LLA24 causou doença em animais inoculados, mas ele não foi transmitido para os animais não inoculados. O vírus LLO 1 não foi capaz de causar doença quando inoculado em um bovino, mas suínos inoculados mostraram vesículas pequenas e o vírus foi transmitido para um dos animais não inoculados. Ambos os vírus LL mostraram ser mais virulentos do que o A12-LLV2, sugerindo que os seus capsídeos são mais virulentos do que os capídeos A12, resultando em cepas que retêm a habilidade para causar doença. Consequentemente, a baixa virulência demonstrada por estes vírus LL, não permite que os mesmos sejam utilizados na produção de vacinas. Com o intuito de se produzir uma cepa mais atenuada, nós alteramos as características de ligação do vírus LLO1, modificando a seqüência RGD para KGE e adicionando um resíduo de carga positiva no capsídeo, o qual permite a ligação ao receptor não natural heparan sulfato (HS). Este vírus foi capaz de crescer em células normais, utilizando o receptor HS, demonstrou ser avirulento em suínos, mas não foi capaz de replicar nos animais o suficiente para produzir uma resposta imune adequada. Isto nos sugere que a atenuação do vírus pela deleção da região codificadora da proteinase líder, pela alteração da seqüência RGD por KGE e pela adição do sítio de ligação ao HS, redirecionam o vírus para tipos celulares alternativos, produzindo vírus que são ineficientes na produção in vivo de antígenos, capazes de estimularem uma resposta imune suficiente.