Mecanismos de ação do lactato como agente neuroprotetor na hipóxia-isquemia neonatal in vivo e in vitro

Abstract

A encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal (EHI) é uma das causas mais relevantes de morte de recém-nascidos e de deficiências neuropsicológicas a longo prazo. Na clínica, o único tratamento utilizado é a hipotermia terapêutica (HT), que apresenta várias limitações e é ineficaz em cerca de 50% dos pacientes. Esse cenário exige uma busca por estratégias complementares ou alternativas à HT; o lactato é um candidato promissor, sendo capaz de agir como um substrato energético para o sistema nervoso central (SNC), e como uma molécula sinalizadora que ativa vias potencialmente neuroprotetoras na isquemia cerebral. Este trabalho foi constituído de duas partes: in vivo, utilizando um modelo que mimetiza a EHI em ratos neonatos, e in vitro, com um modelo de privação de glicose e oxigênio (OGD) em uma linhagem neuronal indiferenciada. Para os experimentos in vivo, ratos Wistar na idade de P7 (7 dias pós-natal) foram divididos em quatro grupos experimentais: HI+PBS, HI+LAC, SHAM+PBS e SHAM+LAC. Os filhotes dos grupos HI foram submetidos a uma cirurgia de oclusão da carótida comum direita seguida de exposição a uma atmosfera hipóxica (8% O2) por 60 min. Os grupos SHAM foram submetidos à cirurgia fictícia e mantidos em normóxia. Os grupos LAC receberam duas injeções de lactato (1g/kg, i.p.), 30 e 120 minutos após o final da hipóxia, e nos grupos PBS foi administrado veículo nos mesmos tempos. Os animais foram eutanasiados em P9 e os encéfalos foram coletados para análises histológicas e moleculares. O procedimento de HI produziu uma lesão ipsilateral consistente, maior em fêmeas do que em machos, e causou perda neuronal no hipocampo, avaliada pelas técnicas de Nissl e Fluoro-Jade C (FJC) (p<0,05, ANOVA de duas vias). O lactato foi capaz de reverter parcialmente todos esses desfechos deletérios. Quando avaliados os mecanismos associados à HI e à neuroproteção por RT-qPCR, foi observada uma modulação diferencial da expressão gênica entre os dois sexos: foi detectado um efeito da lesão na expressão de Nrf2 em machos, nos quais a HI induziu um aumento desse fator regulador da resposta antioxidante. Em fêmeas, foi observado um efeito do tratamento com lactato na expressão do fator antiapoptótico Bcl-2, tanto em condições basais quanto após a HI (p<0,05, GzLM). Isso sugere um claro dimorfismo sexual, em que a neuroproteção em machos parece estar associada com a redução do estresse oxidativo e da morte por necrose, aos quais os machos são mais suscetíveis, enquanto em fêmeas se relaciona com a atenuação da apoptose, a via preferencial de morte celular nesse sexo. A administração de lactato pós-HI elevou os níveis de expressão do receptor GPR81 em machos, indicando uma modulação positiva para favorecer a ativação de vias protetoras. A expressão das isoformas da lactato desidrogenase (LDHA e LDHB) não foi modificada pela HI ou pelo tratamento. Os experimentos in vitro consistiram em submeter os neurônios em cultura a uma atmosfera hipóxica por 6 h (1% O2), enquanto expostas a um meio sem glicose. Os grupos controle permaneceram em normóxia e com meio de cultura normal durante o mesmo tempo. As células foram tratadas com lactato, piruvato e o agonista do receptor GPR81, DHBA. Os três tratamentos se mostraram neuroprotetores frente à OGD. Entretanto, quando inibidos, concomitantemente, o transporte e metabolização do lactato, esses efeitos foram abolidos (p<0,05, ANOVA de uma via). Assim, esses resultados sugerem um mecanismo de ação dual do lactato na proteção contra redução da viabilidade neuronal após a OGD. Nossos resultados demonstram um efeito potencial do lactato como agente neuroprotetor na HI, protegendo contra o dano encefálico agudo.

Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is one of the major causes of newborn death and development of long-term neuropsychological disabilities worldwide. The only clinical treatment available is Therapeutic Hypothermia (HT), which has many limitations and is not efficient for about 50% of the patients. This context calls for a reinforced search for complementary or alternative therapies to HT; lactate is a promising candidate, since it can act both as an energy substrate for the CNS and as a signaling molecule that activates many potentially protective pathways in cerebral ischemia. This study was divided into two main sections: in vivo experiments, using an experimental model that mimics HIE in neonatal rats, and in vitro experiments, employing an oxygen-glucose deprivation (OGD) model in an undifferentiated neuronal lineage. In the in vivo experiments, P7 Wistar rats (7 day-old) were divided into four groups: HI+PBS, HI+LAC, SHAM+PBS and SHAM+LAC. Pups assigned to HI groups were subjected to a surgical occlusion of the right common carotid artery, followed by an exposure to a hypoxic atmosphere (8% O2) for 60 min. SHAM groups were submitted to a fictitious surgery and maintained in normoxia. LAC groups received two injections of lactate (1g/kg, i.p.), 30 and 120 minutes after hypoxia, while in PBS groups two injections of vehicle were administered in the same timepoints. Animals were euthanized at P9, and brains were collected for histological and molecular analyses. HI procedure produced a consistent ipsilateral lesion, larger in females than in males, and caused neuronal loss in the hippocampus, as assessed by Nissl and Fluoro-Jade C (p<0.05, two-way ANOVA). Lactate was able to partially reverse all these deleterious outcomes. When investigatin the molecular mechanisms associated with the lesion and with the neuroprotection exerted by lactate via RT-qPCR, a differential modulation of gene expression was observed between the two sexes: a lesion effect was detected in the expression of Nrf2 in males, in which HI induced an increase in this factor that regulates the cellular antioxidant response. In females, it was observed an effect of the lactate treatment in the expression of the antiapoptotic factor Bcl-2, both in basal circumstances and after HI (p<0,05, GzLM). These results clearly suggest a sexually dimorphic effect, in which neuroprotection in males seems to be associated with the reduction of oxidative stress and of necrotic cell death, while in females it is related to the attenuation of apoptosis, the preferential cell death pathway in this sex. Post-HI lactate administration elevated GPR81 expression levels in males, which suggests a positive modulation to favor the activation of protective pathways. Expression levels of both isoforms of lactate dehydrogenase (LDHA and LDHB) were not modified by neither HI procedure nor lactate administration. In vitro experiments consisted in submitting a neuronal cell lineage to a hypoxic atmosphere for 6 h (1% O2) while exposed to a glucose-free medium. Control groups were maintained in normoxia and exposed to a normal cell culture medium for the same 6 h. Cells were treated with lactate, pyruvate, and the agonist of the GPR81 receptor, DHBA. All three treatments were protective against OGD-induced cell death; when lactate metabolization and transport were inhibited at the same time, however, these protective effects were abolished (p<0.05, one-way ANOVA). Thus, these experiments suggest a dual action of lactate in the protection against reduction of neuronal viability after OGD. Our results demonstrate a potential effect of lactate as a neuroprotective agent in HI, protecting against acute brain damage.