Neuroinflamação em modelo animal de artrite induzida por colágeno (CIA)

Abstract

Introdução: Artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune, inflamatória, crônica e erosiva. A AR é caracterizada por inflamação da membrana sinovial, que resulta em graves danos à cartilagem e ao osso articulares, bem como, na dor, deformidades e incapacidade física do paciente. Embora o principal acometimento seja articular, a AR também apresenta manifestações extra-articulares como nódulos reumatoides, osteoporose, sarcopenia, lesões cutâneas, manifestações oculares e vasculite, com possibilidade de acometer rins, coração e sistema nervoso central e periférico. Alterações neurológicas centrais e periféricas podem ser consequência de diferentes fatores, como por exemplo, o processo inflamatório sistêmico da própria doença ou influenciado pela dor e processo de sensibilização central. No entanto, não está claro na literatura como as alterações imunoinflamatórias induzidas pela AR influenciam na função microvascular cerebral, especialmente na função da barreira hematoencefálica. Objetivo: Avaliar resposta nociceptiva e parâmetros neuroinflamatórios de camundongos durante o desenvolvimento da artrite induzida por colágeno. Métodos: Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do HCPA (número GPPG/HCPA-22-0453). Camundongos machos DBA1/J (36 animais), com idade entre 8 e 12 semanas, foram randomizados em 4 grupos: grupo controle e CIA 25 dias (CO25 e CIA25) e grupo controle e CIA 50 dias (CO50 e CIA50). O modelo experimental foi induzido por injeção intradérmica de emulsão contendo adjuvante de Freund e colágeno bovino tipo II no dia 0 e reforço no dia 18. Durante todo o período experimental foram avaliados o escore clínico, edema de pata e peso corporal. Após a eutanásia, a articulação tibio-tarsal foi utilizada para confirmação da artrite por análise histopatológica; o encéfalo foi submetido à técnica de imunofluorescência com anticorpos Anti-IgM e Anti-IgG; a expressão de IL-6 por imuno-histoquímica; e a existência de neurodegeneração foi analisada (Fluoro Jade C). Os dados foram analisados por Two-way ANOVA, Kruskal-Wallis e correlação de Pearson; p<0,05 foi considerado significativo. Resultados: O desenvolvimento de poliartrite nos grupos CIA 25 inicial e CIA 50 estabelecido foi confirmado por altos valores de escore clínico, nocicepção, edema de pata e escore histológico quando comparados aos respectivos controles (p<0,0001; p=0,001; p=0,001, respectivamente). O grupo CIA25 apresentou maiores valores de IgM no encéfalo quando comparado com o grupo CO25 (p= 0,01). O grupo CIA50 e CO 50 não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. As análises de IgG não apresentaram as diferenças estatisticamente significativas, quando comparados com os controles (p>0.05). A expressão de IL6 mostrou-se aumentada no grupo CIA50 quando comparado ao controle (p=0,008). Foi identificada uma correlação negativa entre a expressão de IL-6 e o limiar de dor no tempo de doença 25 (r=-0.732, p=0.002) e 50 (r=-0.604, p=0.022). A quantificação de neurônios degenerados não apresentou diferença estatisticamente significativa (p>0,05), mas há uma tendência de aumento do número de neurônios degenerados em camundongos do grupo CIA50 quando comparados ao CO50 (p=0,2442). Conclusão: Os dados obtidos nesta dissertação demonstram que os escores clínicos, nociceptivos, de edema da pata e histológicos caracterizaram a presença de artrite significativa em 25 e 50 dias. Na fase aguda da doença identificou-se depósitos elevados de IgM encefálico; no entanto, na fase de artrite estabelecida, apenas a expressão de IL-6 mostrou-se aumentada. Uma correlação negativa entre a expressão de IL 6 e o limiar de dor foi vista em ambos os tempos de doença (25 e 50 dias). Esses achados podem ser indicativos da presença de neuroinflamação no modelo de CIA.

Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune, inflammatory, chronic and erosive disease. RA is characterized by inflammation of the synovial membrane, which results in severe damage to joint cartilage and bone, as well as pain, deformities and physical disability of the patient. Although the main involvement is articular, RA also presents extra-articular manifestations such as rheumatoid nodules, osteoporosis, sarcopenia, skin lesions, ocular manifestations and vasculitis, with the possibility of affecting kidneys, heart and central and peripheral nervous system. Central and peripheral neurological alterations may be a consequence of different factors, such as the systemic inflammatory process of the disease itself or influenced by pain and central sensitization process. However, it is not clear in the literature how RA-induced immunoinflammatory changes influence cerebral microvascular function, especially the function of the blood-brain barrier. Objective: To evaluate the nociceptive response and neuroinflammatory parameters of mice during the development of collagen-induced arthritis model. Methods: This study was approved by the HCPA Animal Ethics Committee (number GPPG/HCPA-22-0453). Male DBA1/J mice (36 animals), aged between 8 and 12 weeks, were randomized into 4 groups: control group and CIA 25 days (CO25 and CIA25) and control group and CIA 50 days (CO50 and CIA50). The experimental model was induced by intradermal injection of an emulsion containing Freund's adjuvant and type II bovine collagen on day 0 and reinforcement on day 18. During the entire experimental period, clinical score, paw edema and body weight were evaluated. After euthanasia, the tarsal warm joint was used for confirmation of arthritis by histopathological analysis, the brain was collected and divided by coronal section, later embedded in paraffin for histochemical analysis. To evaluate inflammatory markers, the sections were subjected to the immunofluorescence technique with Anti-IgM and Anti-IgG antibodies, and expression of IL-6 by immunohistochemistry. In addition, it was analyzed the existence of neuron (Anti-NeuN) and neurodegeneration (Fluoro Jade C). Data were analyzed by Two-way ANOVA, Kruskal-Wallis and Pearson correlation; p<0.05 was considered significant. Results: The development of polyarthritis in the initial CIA 25 and established CIA 50 groups was confirmed by high values of clinical score, nociception, paw edema and histological score when compared to the respective controls (p<0.0001; p=0.001; p=0.001, respectively). The CIA25 group had higher IgM values in the brain when compared to the CO25 group (p= 0.01). The CIA50 and CO 50 groups did not show statistically significant differences. IgG analyzes did not show statistically significant differences when compared with controls (p>0.05). IL6 expression was increased in the CIA50 group when compared to the control (p=0.008). An association was identified between IL 6 expression and pain threshold at disease time 25 (r=-0.732, p=0.002) and 50 (r=-0.604, p=0.022). The quantification of degenerated neurons showed no statistically significant difference (p>0.05), but there is a tendency towards an increase in the number of degenerated neurons in mice from the CIA50 group when compared to the CO50 group (p=0.2442). Conclusion: Clinical, nociceptive, paw edema and histological scores characterized the presence of significant arthritis at 25 and 50 days, in the acute phase of the disease high IgM deposits were identified in the brain, whereas in the established phase established period only IL-6 expression was increased. An negative correlation between IL 6 expression and pain threshold was seen at both disease times (25 and 50 days). These findings may be indicative of neuroinflammation presence in the CIA model.