Estudo dos lactobacilos no biofilme dental

Abstract

Lactobacilos são um grupo de bactérias relacionadas com cárie dental. Há falta de estudos sobre a biologia populacional dos lactobacilos na cárie dental. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito das modificações ambientais na composição, diversidade genética dos lactobacilos e Identificar a filogenia dos Lactobacillus paracasei isolados do biofilme. Lactobacilos foram isolados em um modelo de formação de biofilme in situ antes e depois de 28 dias de exposição à solução de sacarose 20%. As colônias foram randomicamente selecionadas do meio Rogosa Ágar e subcultivadas (n=222, 31 antes e 191 após período de exposição à sacarose). Os isolados foram identificados usando o seqüenciamento parcial dos genes pheS ou rpoA. As espécies de lactobacilos predominantes encontradas foram L. paracasei, L. fermentum e L. rhamnosus. A diferença na composição e na diversidade genética de lactobacilos associada às modificações ambientais no biofilme foi analisada através de PCR utilizando palíndromes repetitivos extragênicos (REP-PCR). Após a fase com sacarose, um maior número de lactobacilos pode ser encontrado no biofilme (p=0,001). A prevalência de L.fermentum foi similar na fase sem sacarose (6/11 indivíduos colonizados) e na fase com sacarose (8/11 indivíduos colonizados) (p=0,721). A prevalência de L. rhamnosus e L. paracasei aumentou no biofilme de 2/11 para 8/11 indivíduos (p= 0,028) e de 2/11 para 7/11 indivíduos colonizados (p=0,012) após exposição a sacarose, respectivamente. A prevalência de L. gasseri foi baixa e em ambas as fases (p=1,00). As espécies de Lactobacilos apresentaram maior diversidade na fase com sacarose (2 a 3 espécies por indivíduo) do que na fase sem sacarose (0 a 2 espécies por indivíduo) (p=0,045). Na maioria dos casos, diferentes genótipos estavam presentes na fase sem sacarose em comparação à fase com sacarose (p=0,01). Aqueles lactobacilos identificados como L. paracasei foram também submetidos à tipificação através do seqüenciamento de múltiplos loci (MLST). No MLST, foi obtida a sequência parcial de 7 genes de referência: fusA, ileS, lepA, leuS, pyrG, recA, e recG. Sete indivíduos apresentavam L. paracasei (n=75) e 14 seqüências de tipificação (ST) foram encontradas. Verificou-se que indivíduos não relacionados podem apresentar uma mesma ST e que múltiplas STs estão presentes por indivíduo. Três indivíduos apresentavam STs previamente isoladas de produtos alimentícios lácteos. Resultados conflitantes na comparação entre REP-PCR e MLST foram observados na genotipagem de L. paracasei. Diferentes números de padrões foram obtidos para os L. paracasei de acordo com o método molecular utilizado (14 com MLST versus 25 com REP-PCR). Para algumas cepas, REP-PCR foi mais discriminatório do que MLST. Em outros casos, cepas pertencentes a diferentes STs foram agrupadas pelo REP-PCR, mostrando que o MLST foi mais discriminatório do que o REP-PCR. Em poucos casos, MLST e REP-PCR apresentaram o mesmo poder discriminatório. Em geral, REP-PCR mostrou um maior poder discriminatório em comparação ao MLST, mas pouca concordância foi apresentada entre os dois métodos. Assim, MLST pode contribuir na identificação da diversidade genética obtida pelo REP-PCR em alguns casos. Os dados obtidos permitiram concluir que após exposição a sacarose observa-se (a) aumento no número de lactobacilos e de superfícies colonizadas; e (b) aumento na diversidade genética e de espécies. Além disso, observou-se que (c) alguns lactobacilos orais podem apresentar origem exógena, e que (d) a combinação dos métodos MLST e REP-PCR aumenta o poder discriminatório quanto à diversidade genética de L. paracasei.

Lactobacilli are a group of bactéria related to dental caries. There is a lack of studies on the population biology of this organisms in dental caries. The aim of the study was to evaluate the effect of the environmental changes in the composition, genetic diversity and identify the filogeny of Lactobacillus paracasei isolated from biofilm. Lactobacilli were isolated from a biofilm model, formed in situ prior to and during a 28-day period of exposure to 20% sucrose solution. The lactobacillus colonies were randomly selected from Rogosa Agar medium and subcultured (n=222, 31 prior to and 191 following a sucrose exposure period). The isolates were identified using pheS or rpoA gene sequence analysis. The predominant lactobacilli were L. paracasei, L. fermentum and L. rhamnosus. The difference in composition and genetic diversity of lactobacilli related to environmental changes in biofilm was analysed by repetitive extragenic palindromic PCR (REP-PCR). After the sucrose phase, a higher number of lactobacilli could be found in dental biofilm (p=0.001). The prevalence of L. fermentum was similar in the non-sucrose (6/11 subjects) compared to the sucrose phase (8/11 subjects) (p=0.721). Prevalence of L. rhamnosus and L. paracasei increased in biofilm from 2/11 to 8/11 subjects (p= 0.028) and from 2/11 to 7/11 subjects (p=0.012) after sucrose exposure, respectively. L. gasseri prevalence was low in both phases (p=1.00). Lactobacilli exhibited greater species diversity (2 or 3 species per subject) in the sucrose phase, than those isolated from the non-sucrose phase (0-2 species per subject) (p=0.045). In most of the cases different genotypes were present in the non-sucrose phase in comparison to the sucrose phase. Those lactobacilli identified as L. paracasei were subjected to multilocus sequencing typing (MLST). In MLST, partial sequences of seven housekeeping genes fusA, ileS, lepA, leuS, pyrG, recA, and recG was obtained. Seven subjects harboured L. paracasei (n=75) and these represented 14 sequence types (ST). Comparison of the STs showed that unrelated subjects may harbour the same ST and that individuals harbour multiple STs. Three subjects harboured STs previously isolated from dairy products. There were mixed results among REP-PCR patterns compared with the MLST in the L. paracasei genotyping. Different numbers of patterns were obtained for L. paracasei according to the molecular technique used (14 MLST versus 25 REP-PCR patterns). For some strains, REP-PCR was more discriminatory than MLST. In other cases, strains belonging to different ST were grouped together by REP-PCR, showing that MLST was more discriminatory than REP-PCR. In few cases MLST and REP-PCR presented the same discriminatory power. REP-PCR showed a greater discriminatory power in comparison to MLST, but little agreement was observed between this two methods. Therefore, MLST could enhance the genetic diversity obtained by REP-PCR. The present data support that after sucrose exposure there is (a) an increase in the number of lactobacilli and colonized surfaces; and (b) increase in lactobacilli species and genetic diversity. Also it was found that (c) some oral lactobacilli may be of exogenous origin; and (d) the combination of MLST and REP-PCR increased the discriminatory power in genotyping L. paracasei.