Identificação e quantificação de haplótipos intra-hospedeiro e sua correlação com parâmetros sanguíneos em gatos infectados com o vírus da leucemia felina

Abstract

O vírus da leucemia felina (FeLV) é um Gammaretrovirus que afeta felinos domésticos e selvagens. Sua replicação ocorre na medula óssea e em células linfoides, o que favorece infecções secundárias e reduz a expectativa de vida dos animais infectados. O curso clínico da doença pode ser abortivo, regressivo, progressivo ou focal, e é influenciado principalmente pelo sistema imune do animal infectado. Sendo um retrovírus, o FeLV apresenta uma elevada taxa de mutação, o que gera uma alta produção de variantes virais na população infectada. O sequenciamento de alto rendimento (HTS) pode ser usado para identificar e rastrear as variantes genéticas dentro de uma população viral ao longo do tempo. Compreender a diversidade genética intra-hospedeiro do FeLV é importante para entender a dinâmica evolutiva do vírus e seu impacto no desenvolvimento da doença. A análise filogenética do gene env surgiu como uma abordagem para a diferenciação das variantes do vírus, levando em conta diferenças genéticas em vez da apresentação clínica. Essas variantes, conhecidas como quasispecies ou haplótipos, são uma tentativa do vírus de obter vantagens adaptativas sob pressões seletivas. Neste estudo, o HTS foi usado para identificar haplótipos intra-hospedeiro e avaliar seu impacto nos parâmetros hematológicos em animais infectados pelo FeLV. Foram analisados eritrogramas e leucogramas de 18 gatos infectados por FeLV. O DNA total foi extraído de amostras de sangue, seguido de amplificação por PCR do gene env completo. Após a extração e purificação das bandas de aproximadamente 2,5 kb do gel de agarose, as amostras foram preparadas para HTS. As reads obtidas foram trimadas e alinhadas com a sequência de referência da região SU. Os haplótipos minoritários foram identificados usando o programa CliqueSNV. Eventos de recombinação foram detectados usando vários métodos, e uma árvore filogenética foi construída usando o programa IQ-TREE. Análises estatísticas foram realizadas para avaliar correlações e diferenças entre o número de haplótipos presentes em cada animal e as alterações sanguíneas encontradas. Nenhuma correlação significativa foi detectada entre a idade ou alterações sanguíneas de gatos FeLV-positivos e o número de quasispecies intra-hospedeiro. Ademais, não foi observada diferença significativa entre o número de haplótipos e a presença de anemia. No entanto, foi identificada uma diferença significativa no número de haplótipos entre gatos que apresentavam alteração nos testes hematológicos e aqueles que apresentavam valores dentro dos intervalos de referência.

Feline leukemia virus (FeLV) is a Gammaretrovirus that affects domestic and wild cats. Its replication occurs in the bone marrow and lymphoid cells, which favors secondary infections and reduces the life expectancy of infected animals. The clinical course of the disease can be abortive, regressive, progressive or focal; and it is mainly influenced by the immune system of the infected animal. As a retrovirus, FeLV has a high mutation rate, which generates a high number of viral variants in the infected individual. High-throughput sequencing (HTS) can be used to identify and track genetic variants within a viral population over time. Understanding the intra-host genetic diversity of FeLV is important to comprehend the evolutionary dynamics of the virus and its impact on disease development. Phylogenetic analysis of the env gene has emerged as an approach to differentiate virus variants, taking into account factors other than clinical presentation. These variants, known as quasispecies, are an attempt by the virus to gain adaptive advantages under selective pressures. In this study, HTS was used to identify intra-host FeLV variants and assess their impact on hematological parameters in FeLV-infected animals. Erythro Grams and kilograms of 18 FeLV-infected cats were analyzed. Total DNA was extracted from blood samples using a standard protocol, followed by PCR amplification targeting the entire env gene. Gel bands of approximately 2.5 kb were extracted, purified and prepared for HTS. After quality checking, the obtained reads were trimmed and then aligned with the SU region reference sequence. Haplotypes were identified using CliqueSNV. Recombination events were detected using various methods, and a phylogenetic tree was constructed using IQ-TREE. Statistical analyzes were performed to evaluate correlations and differences between the number of haplotypes present in each animal and the blood alterations found. No significant correlation was detected between age or blood changes in FeLV-positive cats and the number of intra-host quasispecies. Furthermore, no significant difference was observed between the number of haplotypes and the presence of anemia. However, a statistical difference was identified when comparing the number of haplotypes between cats with altered blood count and those within the reference range.