Desenvolvimento de métodos para o diagnóstico e diferenciação dos pestivírus

Abstract

Os pestivírus compreendem agentes causais de doenças que têm um impacto econômico negativo para a agropecuária no mundo. O gênero Pestivirus compreende três espécies, nomeadas de acordo com o hospedeiro do qual eles foram isolados: o vírus da peste suína clássica (CSFV), o vírus da diarréia vírica dos bovínos (BVDV) e o vírus da doença da fronteira (BDV) dos ovínos. Esta tese teve como objetivos gerais o desenvolvimento e aplicação de testes para o diagnóstico e diferenciação dos pestivírus. O Artigo 1 descreveu o desenho e a utilização de um teste de transcrição reversa seguida de reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) que permitiu a detecção e a diferenciação do CSFV dos pestivírus de ruminantes através do tamanho do fragmento amplificado de DNA. Foi amplificado um segmento de DNA de 200 pares de bases (pb), quando se utilizou material proveniente de culturas celulares infectadas com dez linhagens do CSFV, e de 260 pb, quando se utilizou material proveniente de culturas celulares infectadas com 23 linhagens do BVDV e duas linhagens do BDV. A especificidade dos fragmentos amplificados foi confirmada por clivagem com enzimas de restrição. A sensibilidade foi igual ou um pouco menor do que o teste de peroxidase ligada à anticorpos. O Artigo 2 descreveu o estabelecimento de um teste de ELISA para a detecção de anticorpos anti-BVDV em soros de bovínos e a sua utilização na determinação da freqüência de bovínos soropositivos para o BVDV em 19 propriedades do Rio Grande do Sul e uma da Argentina. Também foi sequenciada a região 5' não traduzida do genoma de isolados da mesma região para a determinação dos tipos do BVDV presentes nesta área. O método de preparo do antígeno e o formato do ELISA descrito foram mais simples do que os descritos na literatura. O ELISA desenvolvido possui uma especificidade de 99,2% e uma sensibilidade de 97,5% quando comparado ao teste de soro neutralização (SN). A freqüência de 56% ± 15,1% dos animais com anticorpos antiBVDV foi similar aos valores encontrados na literatura para outros países. A análise dos genótipos indicou que existem BVDV de tipo I e de tipo II nesta região. O Anexo 1 descreveu a caracterização dos genes e a produção e purificação das proteínas Em\ E2 e NS3 da linhagem R1935/72 do BVDV no sistema de baculovírus, e sua utilização em testes preliminares de ELISA para detectar anticorpos anti-BVDV no soro de bovinos. Os testes de ELISA desenvolvidos com as proteínas recombinantes foram comparados com o que utiliza extratos de células infectadas como antígeno (Artigo 2). O seqüenciamento dos genes que codificam para as proteínas Erns, E2 e NS3 da linhagem R1935/72 demonstrou que esta linhagem é um BVDV de tipo I. Resultados preliminares em um ELISA indireto indicaram que as três proteínas recombinantes poderão ser utilizadas em testes para a detecção de anticorpos anti-BVDV em soros de bovinos.

Pestiviruses represent causative agents of diseases that have a significant negative financial impact for the livestock industry worldwide. The genus Pestivirus comprises three species named according to the host from which they were isolated and where they cause disease: classical swine fever virus (CSFV), bovine viral diarrhea virus (BVDV), and border disease vírus (BDV) of sheep. This thesis had the general objective of developing and applying tests for the diagnosis and differentiation of pestiviruses. Article 1 described a reverse transcription followed by polymerase chain reaction test designed to detect and differentiate CSFV from ruminant pestivirus by the expected size of the amplified fragments of DNA. CSFV infected cultures (10 strains) amplified a fragment of an expected size of 200 bp; BVDV cultures (23 strains) or BDV (2 strains) amplified a fragment of an expected size of 260 bp. The specificity of the amplified fragments was confirmed by restriction enzyme analysis. The threshold of sensitivity was 100 TCID₅₀ for CSFV and 1 TCID₅₀ for BVDV. Article 2 described an ELISA based on cell culture antigens of bovine viral diarrhea virus (BVDV) was designed to detect anti-BVDV antibodies. This ELISA has a sensitivity of 97.5% and specificity of 99.2% compared to serum neutralization. Sera from 430 adult cattle on 19 farms of the State of Rio Grande do Sul (Brazil) and 1 farm from Corrientes (Argentina) were tested in the ELISA. The resulting prevalence of 56% ± 15,1% corresponds to reports for other countries. Two isolates of BVDV from the same region were amplified in the 5' untranslated region of the genome by Reverse Transcription followed by Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The amplification products were sequenced and compared to available Pestivirus sequence data. The phylogenetic analyses showed that BVDV type I and type II are present in these area. Annex 1 describes the characterization of the genes and the production and purification of the proteins Ems, E2 and NS3 from strain R1935/72 of BVDV in the baculovirus system in order to use them in ELISA tests to detect anti-BVDV antibodies from cattle. The ELISA tests developed with the recombinant proteins were compared with the ELISA test from Article 2. The sequences obtained from genes to proteins Ems, E2 and NS3 showed that strain R1935/72 is a BVDV type I. Preliminary results in indirect ELISAS indicate that the three recombinant proteins can be used in tests for the detection of antibody positive cattle to BVDV.