Aspectos patológicos e moleculares em baleia-jubarte (Megaptera novaeangliae) e lobo-marinho-sul-americano (Arctocephalus australis) no Sul do Brasil

Abstract

Nesta tese estão incluídos três artigos: o primeiro é o relato de caso de linfoma linfocítico de pequenas células B (SLL-B) em um macho adulto de lobo-marinho-sul-americano (Arctocephalus australis) no estado do Rio Grande do Sul (RS). Na necropsia, o espécime apresentou mucosa pálida, estado corporal ruim e aumento significativo e generalizado dos linfonodos, além de nódulos tumorais multifocais brancos e branco-amarelados acometendo rins, intestino delgado, linfonodos e baço, além do aumento deste. Na histologia, havia proliferação neoplásica de linfócitos pequenos disposto em manto, pobremente delimitada e não encapsulada, com baixa atividade mitótica e moderadas anisocitose e anisocariose. Na técnica de imuno-histoquímica (IHQ), a neoplasia exibiu difusa e acentuada imunomarcação para os anticorpos CD79α e CD20 nos linfócitos neoplásicos e imunomarcação negativa para CD3. Assim, o diagnóstico SLL-B foi estabelecido. Os demais artigos versam sobre três baleias-jubarte (Megaptera novaeangliae) que encalharam vivas no RS e Santa Catarina em 2021 e 2022. O segundo artigo é sobre a caracterização de infecção por Brachycladium goliath nas três baleias-jubarte. Durante as necropsias, foram observadas áreas multifocais esbranquiçadas, firmes e irregulares na cápsula hepática e atrofia moderada do lobo hepático em um dos casos. Ao corte, havia evidenciação, proliferação e dilatação de ductos biliares, coloração amarelada do parênquima e áreas multifocais esbranquiçadas e firmes. Digenéticos encontrados nos ductos foram enviados para identificação morfológica e molecular. Os principais achados histológicos foram em região periportal, na qual havia dilatação dos ductos biliares e hiperplasia da parede ductal, com acentuado infiltrado inflamatório de linfócitos, plasmócitos e eosinófilos, contendo em seu interior estruturas parasitárias. Morfologicamente, o parasito foi identificado como B. goliath. Destes, amostras foram submetidas à extração de DNA para amplificação de internal transcribed spacer 2 (ITS-2) por PCR. Os amplicons foram purificados e sequenciados; os produtos gerados foram submetidos à análise BLAST para determinar as semelhanças mais próximas no GenBank. As sequências do estudo foram alinhadas com as sequências de ITS-2 de Brachycladium spp. disponíveis no GenBank usando Clustal/W v.1.8.1; uma matriz de identidade foi calculada com o software BioEdit e obteve-se amplicons de ITS-2 de dois indivíduos com 100% de homologia com B. goliath. No conhecimento dos autores, este é o primeiro estudo que registra M. novaeangliae como hospedeiro definitivo de B. goliath. No terceiro artigo, morbilivirose por Guiana Dolphin Cetacean Morbilivirus (GD-CeMV) foi diagnosticada em duas M. novaeangliae. Não foram observadas lesões associadas à morbilivirose na necropsia; na microscopia, os principais achados foram em sistema nervoso central (SNC), no qual observou-se infiltrado inflamatório perivascular moderado a acentuado composto por linfócitos e plasmócitos, além de moderada gliose e vacuolização da substância branca e raros corpúsculos de inclusão eosinofílico intracitoplasmático. Secções de pulmão, cérebro, cerebelo e linfonodos foram submetidas à IHQ com o anticorpo monoclonal anti-canine distemper virus. No SNC, neurônios e astrócitos exibiram imunomarcação acentuada, multifocal e citoplasmática. Submeteu-se amostras dos mesmos tecidos à extração de RNA e realizou-se a técnica de Semi-nested RT-PCR com primers para os genes L e P de Morbilivirus. Um fragmento de 411 pb do gene L foi amplificado em uma das amostras. Os produtos foram purificados e sequenciados, as sequências submetidas à análise BLAST, e múltiplos alinhamentos foram realizados com sequências recuperadas do GenBank utilizando ClustalW. A árvore filogenética baseada no gene da proteína do fragmento L foi construída com o software MEGA6. A sequência apresentou homologia com GD-CeMV (ID: MG845553.1). No conhecimento dos autores, estes são os primeiros relatos de GD-CeMV causando encalhe de espécimes vivos de M. novaeangliae, com descrição histopatológica.

Three articles are included in this thesis: the first is a case report of small B-cell lymphocytic lymphoma (SLL-B) in an adult male of South American fur seal (Arctocephalus australis) in the state of Rio Grande do Sul (RS). At necropsy, the specimen showed pale mucosa, poor body condition and significant and generalized enlargement of the lymph nodes, in addition to white and yellowish-white multifocal tumor nodules affecting the kidneys, small intestine, lymph nodes and spleen, in addition to its enlargement. Histologically, there was neoplastic proliferation of small lymphocytes arranged in a mantle, poorly delimited and non-encapsulated, with low mitotic activity and moderate anisocytosis and anisokaryosis. In the immunohistochemical technique (IHC), the neoplasm showed diffuse and marked immunostaining for CD79α and CD20 antibodies in neoplastic lymphocytes and negative immunostaining for CD3. Thus, the SLL-B diagnosis was established. The other articles are about three humpback whales (Megaptera novaeangliae) that stranded alive in RS and Santa Catarina states. The second article is about the characterization of infection by Brachycladium goliath in the three humpback whales. During necropsies, multifocal whitish, firm, and irregular areas were observed in the hepatic capsule and moderate atrophy of the hepatic lobe in one of the cases. When cut, there was evidence, proliferation and dilation of the bile ducts, yellowish color of the parenchyma and whitish and firm multifocal areas. Digenetics found in the ducts were sent for morphological and molecular identification. The main histological findings were in the periportal region, in which there was dilatation of the bile ducts and hyperplasia of the ductal wall, with a marked inflammatory infiltrate of lymphocytes, plasmocytes and eosinophils, containing parasitic structures inside. Morphologically, the parasite was identified as B. goliath. Of these, samples were subjected to DNA extraction for amplification of internal transcribed spacer 2 (ITS-2) by PCR. The amplicons were purified and sequenced; generated products were subjected to BLAST analysis to determine the closest similarities in GenBank. The study sequences were aligned with the Brachycladium ITS-2 sequences. available from GenBank using Clustal/W v.1.8.1; an identity matrix was calculated with BioEdit software and ITS-2 amplicons were obtained from two individuals with 100% homology to B. goliath. To the authors' knowledge, this is the first study that records M. novaeangliae as a definitive host of B. goliath. In the third article, morbillivirus by Guyana Dolphin Cetacean Morbilivirus (GD-CeMV) was recorded in two M. novaeangliae. No lesions associated with morbillivirus disease were observed at necropsy; on microscopy, the main findings were in the central nervous system, in which a moderate to severe perivascular inflammatory infiltrate composed of lymphocytes and plasma cell was observed, in addition to moderate gliosis and vacuolation of the white matter and rare intracytoplasmic eosinophilic inclusion bodies. Lung, brain, cerebellum, and lymph node sections were subjected to IHC with the anti-canine distemper virus monoclonal antibody. In the central nervous system, neurons and astrocytes exhibited marked multifocal and cytoplasmic immunostaining. Samples from the same tissues were subjected to RNA extraction and the Semi-nested RT-PCR technique was performed with primers for the L and P genes of Morbilivirus. A 411 bp fragment of the L gene was amplified in one of the samples. The products were purified and sequenced. Sequences were subjected to BLAST analysis, and multiple alignments were performed with sequences retrieved from GenBank using ClustalW. The phylogenetic tree based on the L fragment protein gene was performed using the MEGA6 software. The sequence showed homology with GD-CeMV (ID: MG845553.1). To the authors' knowledge, these are the first reports of GD-CeMV causing stranding of live specimens of M. novaeangliae, with histopathological description.