Efeitos da administração de bumetanida em animais submetidos à hipóxia-isquemia neonatal em dois períodos do neurodesenvolvimento

Abstract

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) é um dos principais fatores de risco causadores de distúrbios ao sistema nervoso central (SNC). A patogenia da HI se manifesta quando há uma insuficiência no fluxo sanguíneo ao SNC, causando lesão tecidual, morte celular, neuroinflamação, edema, estresse oxidativo e perturbações neurofisiológicas como o desequilíbrio entre excitação e inibição neuronal e perda sináptica. O GABA, neurotransmissor inibitório do SNC em adultos, é excitatório no início do neurodesenvolvimento e sua ação dependente da homeostase de cloreto neuronal, regulada pelos cotransportadores de cloreto NKCC1 (importa Cl-) e KCC2 (exporta Cl-). Em condições normais, a razão NKCC1/KCC2 reduz com o neurodesenvolvimento, mas a condição de HI pode alterar a expressão de NKCC1 e/ou KCC2 e a razão entre eles, resultando em distúrbios neurológicos e psiquiátricos. Clinicamente, a hipotermia é a única terapia aprovada no tratamento da HI, porém possui várias limitações que incidem na eficácia, tornando conveniente a busca de tratamentos alternativos. A bumetanida, um inibidor de NKCC1, tem se destacado por seus efeitos neuroprotetores em vários distúrbios do SNC. Nesse sentido, este estudo avaliou os efeitos da bumetanida sobre os prejuízos da HI em dois períodos do neurodesenvolvimento. Ratos neonatos machos de 3 (DPN3) e 11 (DPN11) dias de vida, foram submetidos à cirurgia para a indução da HI, visando mimetizar neonatos humanos prematuros e nascidos a termo. A HI consiste na oclusão permanente da artéria carótida comum direita, seguida pela exposição à atmosfera hipóxica (92% de N2 e 8% de O2) por 120 minutos em ratos DPN3 e 60 minutos em ratos DPN11. Os animais foram divididos em dois grupos considerando a idade de indução do modelo: DPN3 e DPN11, com três subgrupos em cada: SHAM, HI-SAL e HI-BUM. A bumetanida (0,5 mg/kg) ou a solução salina (NaCl 0,9%) foi administrada via intraperitoneal 1h, 24h, 48h e 72h após a HI. Analisaram-se as proteínas NKCC1, KCC2, PSD-95 e sinaptofisina no hipocampo ipsilateral por Western blot. Executaram-se testes de reflexos neurológicos de geotaxia negativa e de endireitamento no período lactacional, e testes comportamentais de campo aberto, reconhecimento de objetos e labirinto aquático de Morris na fase adulta. Posteriormente, avaliou-se a atrofia tecidual e a morte celular por histologia. A HI induziu prejuízos nos reflexos neurológicos, na memória declarativa, na memória espacial, além de induzir um aumento na atividade locomotora, entretanto esses prejuízos foram atenuados pela bumetanida. A bumetanida preveniu a atrofia tecidual nas estruturas avaliadas e reduziu a morte de neurônios hipocampais, protegendo o tecido encefálico dos danos causados pela HI. A HI provocou uma redução no imunoconteúdo de KCC2, mas não alterou o imunoconteúdo de NKCC1, gerando uma razão NKCC1/KCC2 favorável à hiperexcitação GABAérgica. Houve redução no imunoconteúdo de PSD-95 atribuída à HI, porém não houve alteração no imunoconteúdo de sinaptofisina. Não houve diferenças significativas no efeito da HI e da bumetanida entre as idades. A bumetanida contribuiu na manutenção do tônus GABAérgico e na qualidade das sinapses, tornando-as mais próximas das condições fisiológicas basais. Os resultados sugerem que a bumetanida protegeu os animais contra os efeitos HI nos aspectos comportamentais, morfofisiológicos e bioquímicos. A bumetanida parece exercer um papel terapêutico importante sobre o SNC.

Neonatal hypoxia-ischemia (HI) is one of the main risk factors causing central nervous system (CNS) disorders. The pathogenesis of HI manifests when there is an insufficiency in blood flow to the CNS, causing tissue damage, cell death, neuroinflammation, edema, oxidative stress and neurophysiological disturbances such as the imbalance between neuronal excitation and inhibition and synaptic loss. GABA, an inhibitory neurotransmitter of the CNS in adults, is excitatory at the onset of neurodevelopment and its action depends on neuronal chloride homeostasis, regulated by the chloride cotransporters NKCC1 (imports Cl-) and KCC2 (exports Cl-). Under normal conditions, the NKCC1/KCC2 ratio decreases with neurodevelopment, but the HI condition can alter the expression of NKCC1 and/or KCC2 and the ratio between them, resulting in neurological and psychiatric disorders. Clinically, hypothermia is the only therapy approved for the treatment of HI, but it has several limitations that affect its efficacy, making it convenient to search for alternative treatments. Bumetanide, an NKCC1 inhibitor, has been highlighted for its neuroprotective effects in several disorders of the CNS. In this sense, this study evaluated the effects of bumetanide on HI impairments in two neurodevelopmental periods. Male neonate rats, 3 (DPN3) and 11 (DPN11) days old, were submitted to surgery for the induction of HI, aiming to mimic premature and full-term human neonates. HI consists of permanent occlusion of the right common carotid artery, followed by exposure to a hypoxic atmosphere (92% N2 and 8% O2) for 120 minutes in DPN3 rats and 60 minutes in DPN11 rats. The animals were divided into two groups considering the age of induction of the model: DPN3 and DPN11, with three subgroups in each: SHAM, HI-SAL and HI-BUM. Bumetanide (0.5 mg/kg) or saline solution (NaCl 0.9%) was administered intraperitoneally 1h, 24h, 48h and 72h after HI. NKCC1, KCC2, PSD-95 and synaptophysin proteins from the right hippocampus were analyzed by Western blot. Negative geotaxis and righting neurological reflex tests were performed in the lactational period, and open field behavioral tests, object recognition and Morris water maze in adulthood. Subsequently, atrophy and cell death were evaluated by histology. HI induced impairments in neurological reflexes, declarative memory, spatial memory, in addition to inducing an increase in locomotor activity, however these impairments were attenuated by bumetanide. Bumetanide prevented tissue atrophy in the evaluated structures and reduced the death of hippocampal neurons, protecting the brain tissue from the damage caused by HI. HI caused a reduction in KCC2 immunocontent, but did not alter NKCC1 immunocontent, generating an NKCC1/KCC2 ratio favorable to GABAergic hyperexcitation. There was a reduction in PSD-95 immunocontent attributed to HI, but there was no change in synaptophysin immunocontent. There were no significant differences in the effect of HI and bumetanide between ages. Bumetanide contributed to the maintenance of GABAergic tone and the quality of synapses, making them closer to baseline physiological conditions. The results suggest that bumetanide protected the animals against HI effects in behavioral, morphophysiological and biochemical aspects. Bumetanide appears to play an important therapeutic role in the CNS.