Proteômica e metabolômica do plasma seminal equino

Abstract

Diferente de outras espécies domésticas de interesse zootécnico, os equinos são valorizados como indivíduo, animais de alto padrão genético atingem valores elevados de comércio e reprodução. Os reprodutores equinos, assim como os humanos, geralmente recebem tratamento médico para a infertilidade. Os métodos de avaliação convencional de sêmen na maioria das vezes fornecem apenas informações descritivas e têm limitações para prever fertilidade. No entanto, várias abordagens moleculares, como a proteômica e metabolômica, proporcionaram uma compreensão mais aprofundada dos mecanismos causadores da infertilidade masculina. O objetivo deste projeto foi avaliar a proteômica e metabolômica do plasma seminal equino. Foram utilizados 24 garanhões. A concentração espermática foi avaliada em câmara de Neubauer. As demais análises microscópicas foram realizadas através do Computer Assisted Sperm Analysis AndroVision. A análise da integridade física da membrana foi realizada utilizando-se sondas fluorescentes. A integridade funcional da membrana plasmática foi avaliada por meio do teste hiposmótico. Um ejaculado de cada garanhão foi coletado durante a estação reprodutiva e a fertilidade dos garanhões selecionados foi avaliada através do histórico reprodutivo. As taxas de prenhez variaram de 20,2% a 95,6% e os animais foram divididos em dois grupos: Grupo Alta taxa de prenhez (HP), com taxa de prenhez por ciclo acima de 51%, e Grupo Baixa prenhez (LP), com taxa de prenhez por ciclo igual ou abaixo de 50%. Após a análise espermática, o plasma seminal foi separado e preparado para a identificação de proteínas e metabólitos do plasma seminal. As proteínas foram identificadas através da técnica de eletroforese bidimensional; já para identificação dos metabólitos a técnica utilizada foi a cromatografia líquida. Foi realizada a média e desvio padrão de todas as variáveis analisadas e correlação entre as taxas de prenhez e parâmetros seminais, integridade da membrana plasmática, funcionalidade da membrana plasmática, defeitos maiores, defeitos menores, proteínas e metabólitos do plasma seminal. O Teste de Shapiro-Wilk foi realizado para avaliar distribuição dos dados. Para dados paramétricos, o teste utilizado foi a Anova e para dados não paramétricos o teste utilizado foi o kruskal Wallis. Para análise estatística, foi utilizada a correlação de Pearson. De um total de 713 spots detectados, 24 spots foram selecionados e 26 proteínas foram identificadas. Em relação aos metabólitos, 18 foram identificados. A identificação de marcadores positivos e negativos referentes à fertilidade é uma ferramenta para auxiliar a detecção de alterações que comprometam a vida reprodutiva do garanhão. A compreensão aprofundada dos componentes proteicos e metabólicos do plasma seminal é importante para desvendar a fisiologia da reprodução, auxiliando na compreensão da infertilidade na espécie equina, podendo levar ao desenvolvimento de um produto que aumente as características seminais relacionadas à fertilidade masculina.

Diffetrent other domestic species of zootechnical interest, horses are valued as individuals, animals of high genetic standard reach high values of trade and reproduction. Equine breeding stock, like humans, often receives medical treatment for infertility. Conventional semen assessment methods most often only provide descriptive information and have limitations in predicting fertility. However, several molecular approaches, such as proteomics and metabolomics, have provided a deeper understanding of the mechanisms causing male infertility. The objective of this project was to evaluate the proteomics and metabolomics of equine seminal plasma. Twenty four stallions were used. Sperm concentration was evaluated in a Neubauer chamber. The other microscopic analyzes were performed using the Computer Assisted Sperm Analysis AndroVision. The analysis of the physical integrity of the membrane was performed using fluorescent probes. The functional integrity of the plasma membrane was assessed using the hyposmotic test. One ejaculate from each stallion was collected during the breeding season and the fertility of selected stallions was assessed through their reproductive history. Pregnancy rates ranged from 20.2% to 95.6% and the animals were divided into two groups: High Pregnancy Rate (HP) Group, with pregnancy rate per cycle above 51% and Low Pregnancy Group (LP), with pregnancy rate per PT cycle equal to or below 50%. After sperm analysis, seminal plasma was separated and prepared for the identification of seminal plasma proteins and metabolites. The proteins were identified through the technique of two-dimensional electrophoresis, for the identification of the metabolites, the technique used was liquid chromatography. The mean and standard deviation of all variables analyzed and correlation between pregnancy rates and seminal parameters, plasma membrane integrity, plasma membrane functionality, major defects, minor defects, proteins and seminal plasma metabolites were performed. Shapiro-Wilk test was performed to assess data distribution. For parametric data the test used was the Anova and for non-parametric data the test used was the kruskal Wallis. For statistical analysis, Pearson's correlation was used. From a total of 713 detected spots, 24 spots were selected and 26 proteins were identified. Regarding the 18 metabolites were identified. The identification of positive and negative markers related to fertility is a tool to help detect changes that compromise the reproductive life of the stallion. The in-depth understanding of the protein and metabolic components of seminal plasma is important to unravel the physiology of reproduction, aiding in the understanding of infertility in the equine species, which may lead to the development of a product that increases the seminal characteristics related to male fertility.