Avaliação in silico de sítios de inserção em Genomic Safe Harbors para uso do sistema CRISPR/Cas9 em diferentes populações humanas

Abstract

A inserção de transgenes com expressão não transiente e com minimização de efeitos adversos na funcionalidade celular do organismo tem grande importância no âmbito clínico, fornecendo recurso terapêutico aos pacientes com tratamento de eficácia limitada ou tratamentos que dependem de doadores compatíveis. Nesse cenário, a inserção de produtos terapêuticos dentro de Genomic Safe Harbors (GSH) usando o sistema CRISPR/Cas9 promove uma alternativa terapêutica para aplicação a distintas doenças genéticas, prevendo antecipadamente a interação do transgene no genoma humano. Contudo, avaliações sobre a arquitetura tridimensional do genoma e efeitos off-target considerando a variabilidade genética levantam o questionamento da segurança do tratamento em diferentes tipos celulares e populações humanas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a organização tridimensional cromossômica em três tipos celulares como também efeitos off-targets a partir da probabilidade de clivagem dessas regiões para sgRNAs desenhados em GSH usando ferramentas desenvolvidas para acesso aos dados de variantes genéticas contidos em diferentes bancos. A investigação de sítios de inserção em 4 loci GSH (AAVS1, H11, SH6 e THUMPD3-AS1) demonstrou que THUMPD3-AS1 está dentro de um potencial Topological Associate Domains (TAD) conservado ao longo dos diferentes tipos celulares. Entretanto, TADs foram apenas estabelecidos para demais loci para tipos celulares específicos devido à baixa resolução de dados. Ainda, a avaliação de off-target questiona a segurança da aplicação do mesmo sgRNA ao longo de diferentes populações humanas em GSH devido a off-target privados e compartilhados adjacentes a existentes ou criadas PAM canônicas. Dentre todas as populações, a população Africana (n = 256) seguindo da população Brasileira (n = 220) demonstraram o maior número de sítios polimórficos que criam PAMs canônicas considerando todos os sgRNAs. Com intuito de minimização de efeitos off-target, o sgRNA5 para AAVS1 com menor número dessas regiões demonstrou que sítios polimórficos diminuem a probabilidade de clivagem, demonstrando menor efeitos off-target para população Latina que apresenta o maior número de sítios polimórficos (n = 302). Finalmente, ferramentas para acesso de dados variantes genéticas foram desenvolvidas para auxiliar futuras investigações sobre a variabilidade genética das populações nos bancos gnomAD e ABraOM. Espera-se que a análise conduzida para sítios de inserção em GSH ajudem na aplicação de tratamentos terapêuticos na clínica para doenças genéticas distintas em diferentes populações.

Integrating a gene with no transient expression and minimization of adverse effects on cell functionality is important in the clinical field, providing treatment to individuals with limited treatment effects or that require a compatible donor. In this scenario, inserting therapeutic gene products inside Genomic Safe Harbors (GSH) using the CRISPR/Cas9 system offers a relatively less-cost therapeutic alternative for different human genetic diseases with previous knowledge of transgene into the human genome. However, the three-dimensional genome architecture and possible off-target effects regarding the genetic variability raise safety concerns in the application of treatment in different cell types and human populations. Thus, this investigation aims to provide a-priori in silico analysis of three-dimensional chromosome structure among three cell types and off-target effects considering the probability cleavage for sgRNA designed into GSH by using the development of bioinformatics tools to access data from gnomAD and ABraOM database. The gene insertion investigation into 4 GSH (AAVS1, H11, SH6 and THUMPD3-AS1) showed THUMPD3-AS1 is inside a potential conserved TAD across different cell types. For other loci, it only observed TADs for specific cell types due to poor data quality. In another scenario, the off-target prediction raises concerns about applying the same sgRNA designed into GSH among human populations due to private and shared off-target region investigation among existing and creating canonical PAMs. Among all populations, African (n =256) followed by Brazilian ( n = 220) populations demonstrated the majority number of polymorphic sites that created PAM among human populations when considering all sgRNA. To minimize off-target effects among human populations, the sgRNA5 from AAVS1, which showed the smallest number of off-target regions using the reference human genome, demonstrated that probability cleavage decreases considering the majority of polymorphic sites in the off-target region among human populations. It also revealed that Latino could benefit from this sgRNA since this population has the most significant number of polymorphic sites ( n =302 ). Finally, bioinformatics tools were developed to access and facilitate vast human genetic variant data, thus aiding future research concerning genetic variability investigation on gnomAD and ABraOM databases. This assessment a-priori analysis is expected to assist therapeutic treatment applications in clinics for different human genetic diseases among human populations.