Capacidade de formação de biofilmes por cepas de Salmonella enterica subsp. enterica provenientes de fábrica de ração suína e ação de óleos essencias sobre biofilmes

Abstract

A ração animal tem sido considerada como um importante veículo para introdução de Salmonella enterica subsp. enterica em granjas de suínos. Em fábricas de ração, a principal fonte de contaminação por Salmonella é a entrada de ingredientes contaminados ou a persistência de cepas no ambiente de processamento. Além disso, Salmonella possui a habilidade de formar biofilme em diversas superfícies abióticas, o que pode contribuir para sua persistência nesses ambientes. Neste sentido, os objetivos deste estudo foram: i. determinar fenotipicamente a formação de biofilme em cepas de Salmonella enterica subsp. enterica provenientes de fábrica de ração suína; ii. confirmar a presença dos principais genes associados aos fenótipos de formação de biofilme; iii. avaliar o efeito do óleo essencial de orégano (Oreganum vulgare), óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) e seus compostos majoritários carvacrol e timol, na inibição da formação de biofilme e iv. avaliar o efeito de óleo essencial de orégano (Oreganum vulgare), óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris), seus compostos majoritários carvacrol e timol e ácidos orgânicos (acético e lático) na remoção de biofilme maduros de Salmonella enterica subsp. enterica. Sendo assim, 54 cepas de Salmonella enterica subsp. enterica isoladas a partir de quatro fábricas de ração, pertencentes a diferentes sorovares, foram avaliadas quanto a sua capacidade de formação de biofilme através de ensaios fenotípicos de morfologia celular, formação de película na interface ar-líquido e formação de biofilme em microplacas de poliestireno. Além disso, pesquisou-se a presença de genes responsáveis pela formação de biofilme e avaliou-se os efeitos antibacteriano e antibiofilme de diferentes agentes antimicrobianos através de ensaios em microplacas de poliestireno, contagem de UFC em cupons de flandres e microscopia confocal. Todas as cepas apresentaram morfotipo rdar a 28° e morfotipo saw a 37°C. Destas 81,48 % (44/54) pertenceram aos perfis fenotípicos 1, 3 e 4, os quais são moderadamente formadores de biofilme a 28°C, não formam biofilme a 37°C e diferem quanto a produção de película na interface ar-líquido. Enquanto que 14,81 % (9/54) pertenceram aos perfis 2, 5, 6, 7 e 8. Os genes pesquisados (csgD, fimA, adrA e bapA) foram encontrados em todas as cepas. Após os ensaios fenotípicos para formação de biofilme, quatro cepas pertencentes ao sorovar Montevideo e que demostraram possuir fenótipo para formação de biofilme in vitro foram usadas para estudar o efeito antimicrobiano e antibiofilme de diferentes agentes antimicrobianos. O óleo essencial de orégano, óleo essencial de tomilho e o composto majoritário timol foram capazes de inibir o crescimento de células planctônicas de todas cepas estudadas com CIM de 0,05 %, enquanto que o composto majoritário carvacrol foi capaz de inibir o crescimento com CIM de 0,025 %. Contudo, em concentrações sub-inibitórias (CIM/2) estes agentes foram capazes de reduzir a quantidade de biofilme formado por todas cepas de Salmonella, exceto a formação de biofilme por Salmonella Typhimurium ATCC 14028 na presença de óleo de tomilho. Somente os óleos essenciais de orégano e tomilho em concentrações de 0,1 % foram capazes de reduzir a biomassa de biofilmes maduros nos ensaios em microplacas de poliestireno. Enquanto que, os óleos essenciais e compostos majoritários em concentrações de 0,1 % e ácidos orgânicos em concentrações de 2,5 % foram capazes de reduzir a biomassa de biofilmes maduros de 1 até 3 log UFC/cupom em ambas cepas testadas nos ensaios em cupons de flandres. Nas imagens de microscopia confocal, os efeitos de redução de biomassa de biofilmes maduros tratados com os óleos essenciais, compostos majoritários e ácidos orgânicos também foram observados. De acordo com os resultados encontrados, foi possível confirmar que as cepas de Salmonella enterica subsp. enterica isoladas de fábrica de ração possuem características fenotípicas para formar biofilme in vitro. Além disso, os óleos essenciais, compostos majoritários e ácidos orgânicos podem ser alternativas úteis como coadjuvantes nos programas de controle de Salmonella em ambientes de fábrica de ração para suínos.

Animal feed has been considered as an important vehicle for the introduction of Salmonella enterica subsp. enterica in pig farms. In feed mills, the main source of Salmonella contamination is the entry of contaminated ingredients or the persistence of strains in the processing environment. In addition, Salmonella has the ability to form biofilm on several abiotic surfaces, which may contribute to its persistence in these environments. In this sense, the objectives of this study were: i. to phenotypically determine the formation of biofilms in strains of Salmonella enterica subsp. enterica from a feed mill; ii. confirm the presence of the main genes associated with biofilm formation phenotypes; iii. to evaluate the effect of the oregano essential oil (Oreganum vulgare), thyme essential oil (Thymus vulgaris) and its major compounds carvacrol and thymol, in inhibiting the formation of biofilm and iv. to evaluate the effect of the oregano essential oil (Oreganum vulgare), thyme essential oil (Thymus vulgaris), its major compounds carvacrol and thymol, and organic acids (acetic and lactic acid) in the removal of mature biofilms of Salmonella enterica subsp. Enterica. Thus, 54 strains of Salmonella enterica subsp. enterica isolates from four feed factories belonging to different serovars were evaluated for their ability to biofilm through phenotypic cell morphology assays, pellicle formation at the air-liquid interface and biofilm formation in polystyrene microplates. In addition, the presence of genes responsible for biofilm formation was investigated and the antibacterial and antibiofilm effects of different antimicrobial agents were evaluated through polystyrene microplate assays, UFC count in tinplate coupons and confocal microscopy. All strains presented morphotype rdar at 28 ° and morphotype saw at 37 ° C. These 81.48% (44/54) belonged to the phenotypic profiles 1, 3 and 4, which are moderately biofilm forming at 28 ° C, do not biofilm at 37 ° C and differ in the pellicle production at the air- liquid. While 14.81% (9/54) belonged to profiles 2, 5, 6, 7 and 8. The genes studied (csgD, fimA, adrA and bapA) were found in all strains. After phenotypic assays for biofilm formation, four strains belonging to the Montevideo serovar and that demonstrated to possess biofilm formation phenotype in vitro were used to study the antimicrobial and antibiofilm effect of different antimicrobial agents. Oregano essential oil, thyme essential oil and thymol major compound were able to inhibit the planktonic cell growth of all strains studied with MIC of 0.05%, while the major compound carvacrol was able to inhibit growth with MIC of 0.025%. However, at subinhibitory concentrations (MIC / 2) these agents were able to reduce the amount of biofilm formed by all strains of Salmonella, except the formation of biofilm by Salmonella Typhimurium ATCC 14028 in the presence of thyme oil. Only the essential oils of oregano and thyme at concentrations of 0.1% were able to reduce the biomass of mature biofilms in polystyrene microplate assays. While essential oils and major compounds at concentrations of 0.1% and organic acids in concentrations of 2.5% were able to reduce the biomass of mature biofilms of 1 to 3 log CFU / coupon in both strains tested in the tin coupons. In the confocal microscopy images, the biomass reduction effects of mature biofilms treated with essential oils, major compounds and organic acids were also observed. According to the results, it was possible to confirm that the strains of Salmonella enterica subsp. enterica isolates from feed factory have phenotypic characteristics to form biofilm in vitro. In addition, essential oils, major compounds, and organic acids may be useful alternatives as adjuvants in Salmonella control programs in pig factory environments.