Estudo in vivo da toxicidade pulmonar e sistêmica após doses repetidas de nanotubos de carbono de paredes múltiplas

Abstract

Os nanotubos de carbono (NTC) são materiais promissores para aplicações industriais, dentre os quais os NTC de paredes múltiplas (NTCPM) representam uma parcela expressiva desses nanomateriais manufaturados. Alguns NTC apresentam-se morfologicamente finos e retos semelhantes a agulhas, portanto trazendo uma semelhança estrutural às fibras de asbesto. Informações prévias disponíveis em estudos in vitro e in vivo sobre NTC indicam principalmente ocorrência de inflamação pulmonar, notando-se ainda relatos sobre fibrose pulmonar e grande interesse em investigar o desenvolvimento de câncer e os mecanismos envolvidos. Neste contexto, há necessidade de se obter dados toxicológicos mais aprofundados e em maior número de compostos. Para se avaliar a segurança de nanomateriais, estudos nanotoxicológicos avaliando modelos in vivo e utilizando via de exposição pelo trato respiratório apresentam grande relevância, especialmente no que tange às exposições ocupacionais e ambientais. Neste trabalho, conduziu-se uma investigação nanotoxicológica de dois diferentes NTCPM após caracterização físico-química, administrados por via intratraqueal em modelo animal. Realizaram-se quatro instilações intratraqueais consecutivas em ratas Sprague Dawley nos dias 1, 9, 17 e 25 dos nanomateriais NM-401 e NM-403 em dispersão em concentrações baixas e altas (60 μg e 180 μg), asbesto crocidolite (180 μg) como material de referência e controle veículo polissorbato 80 a 0,1% (n = 8 por grupo), sendo avaliados nos tempos de 3, 7, 30 e 90 dias após a última instilação. Os resultados da caracterização do NM-401 e NM-403 mostraram que o primeiro composto se apresenta no formato de agulhas, longo e espesso, ao passo que o segundo possui morfologia emaranhada e curva, curto e fino. Os NTCPM testados neste estudo foram estáveis em dispersão, apesar de haver um grau de aglomeração. Os resultados nanotoxicológicos indicaram que os nanocompostos foram capazes de induzir alterações sistêmicas e pulmonares. Os achados demonstram alterações transitórias em marcadores bioquímicos de função renal e no biomarcador de estresse oxidativo de dano lipídico, nos tempos pós-exposição mais recentes. Em 11 paralelo, a análise das curvas de crescimento animal mostrou sinais de toxicidade geral em tempos após as exposições, além de um aumento na liberação de LDH pulmonar no dia 3 após as administrações. Adicionalmente, algumas alterações foram observadas em tempos posteriores após as instilações, como redução nos pesos relativos hepáticos e renais, detectados como alterações tardias nos animais expostos às doses mais altas dos NTCPM, em conjunto com alterações histológicas pontuais nos tecidos hepáticos e renais; além disso, o dano pulmonar foi observado como granuloma, espessamento de septo alveolar, focos hemorrágicos e fibrose. A avaliação da genotoxicidade através do ensaio cometa e do teste de micronúcleos nos animais expostos indicou ausência de danos ao DNA após 3 dias da última instilação; detectou-se baixa frequência de micronúcleos na medula óssea nos animais instilados com NM-401, porém a análise de eritrócitos policromáticos/normocromáticos não indicou toxicidade medular nos grupos de estudo. Os resultados apresentados contribuem para elucidar os aspectos toxicológicos envolvidos após exposições pulmonares repetidas a ambos os NTCPM testados, tanto nos pulmões como em tecidos extrapulmonares. Deve-se, ainda, aprofundar os mecanismos envolvidos em próximos estudos, bem como avaliar diferentes nanotubos de carbono para aumentar o conhecimento disponível sobre a toxicidade desses nanocompostos específicos de interesse industrial.

Carbon nanotubes (CNT) are promising materials for industrial applications and multi-walled CNT (MWCNT) represent an expressive amount of these manufactured nanomaterials. Some CNT present needle-like morphology, thus structurally resembling asbestos fibers. Previously available in vitro and in vivo data on CNT mostly indicate lung inflammation, and some reports on pulmonary fibrosis were noted in addition to the interest in assessing the development of cancer and the involved mechanisms. In this context, there is need to obtain detailed toxicological information and study more compounds. To ensure safety of nanomaterials, nanotoxicity studies targeting exposures to the respiratory tract present great relevance, especially considering exposures in occupational settings and the environment. In this work, we performed a nanotoxicological investigation of two different, well-characterized MWCNT in rats after intratracheal exposures. Female Sprague-Dawley rats were submitted to four consecutive instillations at day 1, day 9, day 17 and day 25 with NM-401 and NM-403 dispersions at low and high doses (60 μg and 180 μg), asbestos crocidolite (180 μg) as reference material and vehicle polysorbate 80 0.1% controls (n=8/group) and follow-up times were 3, 7, 30 and 90 days after the last instillation. Characterization data on NM-401 and NM-403 indicated that the first was found as needle-like, long, thick, while the latter was entangled, short and thin. MWCNT in this study were found stable in dispersion, despite the agglomeration. Toxicological data indicated that the nanocompounds were able to induce some systemic and pulmonary alterations. The present findings demonstrate transient alterations in biochemical markers of renal function and oxidative stress biomarkers of lipid damage in recent post-exposure time points. In parallel, analysis of animal growth curves shows signs of general toxicity in the immediate times after exposures, in addition to increased pulmonary LDH release at day 3 after instillations. Additionally, few alterations were observed in further time points after instillations, such as the liver and kidney weight decreases, detected as late alterations in the exposed animals at higher MWCNT doses, together with single histological alterations in hepatic and renal 13 tissues; besides, pulmonary damage was observed as granuloma, alveolar septa thickening, hemorrhagic foci and fibrosis. The genotoxicity evaluation by the comet assay and the micronucleus test indicated in the exposed animals absence of DNA damage 3 days after the last instillation; a low micronuclei frequency in bone marrow was found in animals instilled with NM-401; however, analysis of the ratio of polychromatic erythrocytes to normochromatic erythrocytes did not indicate medular toxicity in the study groups. Our results contribute to elucidate the toxicological aspects involved after pulmonary repeated exposures to both manufactured MWCNT, both in lungs and extrapulmonary tissues. The involved mechanisms should still be evaluated in further studies as well as different types of carbon nanotubes to improve the knowledge on hazard assessment of these specific nanocompounds of industrial interest.