Comparison of techniques for counting prokaryotes in marine planktonic and biofilm samples

Abstract

Though a large number of techniques are available for the study of aquatic bacteria, the aim of this study was to establish a technique for analysing free-living and biofilm prokaryotic cells through laboratory assays. In particular, we wished to analyse the efficiency of ultrasound to detach and disrupt biofilm, to obtain an efficient stain treatment for quantifying free-living and biofilm prokaryotes in flow cytometry (FC), and to compare epifluorescence microscopy (EFM), scanning electron microscopy (SEM) and FC for quantifying free-living and biofilm prokaryotes#. Marine-grade plywood substrates were immersed in natural marine water that was conditioned for 12 days. At 6 and 12 days, water aliquots and substrates were removed to estimate free-living and biofilm prokaryote density. Ultrasound efficiently removed marine biofilm from substrates (up to 94%) without cell damage. FC analysis (unstained) reliably quantified marine plankton and young or mature biofilm prokaryotes compared with other staining (acridine orange, 4′,6-diamidino-2-phenylindole, propidium iodide and green fluorescent nucleic acid), EFM or SEM techniques. FC and SEM achieved similar results, while a high variability was observed in the EFM technique. FC was faster and more precise than SEM because the count is not dependent on the observer.

A pesar de la gran cantidad de técnicas disponibles para el estudio de bacterias acuáticas, el objetivo de este estudio fue aplicar y proponer una técnica para el análisis de células procariotas de vida libre y asociado a biofilms en ensayos de laboratorio. En particular, deseamos analizar la eficiencia de de la aplicación de ultrasonidos para separar y romper el biofilm, obtener un tratamiento de tinción eficiente para cuantificar procariotas de vida libre y de biofilm por citometría de flujo (CF), y comparar microscopía de epifluorescencia (MEP), microscopía electrónica de barrido (MEB) y CF para cuantificar los procariotas de vida libre y de biofilm. Los sustratos de madera contrachapada de grado marino se sumergieron en agua marina natural que se acondicionó durante 12 días. A los 6 y 12 días, se retiraron alícuotas de agua y sustratos para estimar la densidad de procariotas de vida libre y asociados a los biofilms. Los ultrasonidos eliminaron de manera eficiente el biofilm marino de los sustratos (hasta 94%) sin dañar las células. El análisis por CF (sin marcador) cuantificó de manera fiable las células del plancton marino y los procariotas de biofilms jóvenes o maduros en comparación con otras técnicas de marcación (naranja de acridina, 4’, 6-diamidino-2-fenilindol, yoduro de propidio, ácido nucleico fluorescente verde), MEP o MEB. CF y MEB lograron resultados similares, mientras que se observó una alta variabilidad en la técnica EFM. Cuando se compara, CF es más rápido y más preciso que MED, ya que el recuento no depende del observador.