Vitrificação de tecido ovariano de Zebrafish (Danio rerio) encapsulado em hidrogel de alginato de sódio

Abstract

O zebrafish (Danio rerio) é um importante modelo animal e tem se destacado na pesquisa biomédica por sua homologia fisiológica e genética aos humanos. Com isso, diversas linhagens e animais de grande valor genético têm sido desenvolvidos, possuindo assim, grande necessidade de sua preservação. No entanto, a criopreservação de oócitos de peixe ainda é limitada e necessita aprimoramento. O hidrogel de alginato de sódio além de fornecer suporte para as células, tem demonstrado ser um potencial crioprotetor. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência da técnica de encapsulamento em hidrogel de alginato de sódio durante o procedimento de vitrificação do tecido ovariano de zebrafish. No Experimento 1, foram avaliados a forma de encapsulamento (imersão ou em 30 μL de alginato), o momento de exposição ao crioprotetor (antes ou após o encapsulamento) e a temperatura de aquecimento (28, 37 e 50oC) e foi avaliada a integridade da membrana pela coloração azul de tripan. Os dados mostraram que o tecido ovariano encapsulado por imersão, exposto ao crioprotetor após o encapsulamento e aquecido a 28oC, apresentou maior integridade de membrana em todas as fases de desenvolvimento dos oócitos (PG: 37.71 ± 3.86 %; CA: 29.93 ± 4.18 %; Vtg1: 18.61 ± 4.69 %) e foi utilizado no Experimento 2. No Experimento 2 foram avaliados quatro grupos vitrificados (VS: Metanol 1,5 M + Me2SO 5,5 M + sacarose 0,5 M; VS1-A: Metanol 1,5 M + Me2SO 5,5 M + sacarose 0,5 M - encapsulado em alginato; VS2-A: Metanol 0,75 M + Me2SO 2,75 M + sacarose 0,25 M - encapsulado em alginato; VA: encapsulado em alginato) e foram avaliados a integridade da membrana (SYBR- 14/PI), morfologia (histologia – HE), atividade mitocondrial (MTT) e peroxidação lipídica (TBARS). O tratamento VA demonstrou menor percentagem de integridade de membrana, enquanto VS demonstrou maior integridade de membrana no qual não diferenciou do tratamento VS1-A. A atividade mitocondrial foi maior no tratamento não encapsulado (VS) e os tratamentos encapsulados tiveram menor valor. O tratamento VA obteve o maior nível de peroxidação lipídica, enquanto VS1-A e VS obtiveram os menores valores no qual VS não se diferenciou do tratamento VS2-A. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a técnica de encapsulamento em hidrogel de alginato de sódio não teve ação crioprotetora e não permitiu a redução da concentração de crioprotetores. No entanto, a partir de observações durante os experimentos, foi encapsulamento dos fragmentos de tecido ovariano em hidrogel de alginato, possibilitou suporte e evitou perda de células durante o processo de vitrificação.

Zebrafish (Danio rerio) is an important animal model and has stood out in biomedical research for its physiological and genetic homology to humans. Thereby, several lines and animals of great genetic value have been developed, thus having a great need for their preservation. However, the cryopreservation of fish oocytes is still limited and needs improvement. The sodium alginate hydrogel, in addition to providing support for the cells, has been shown to be a potential cryoprotectant. Therefore, the aim of this study was to evaluate the efficiency of the sodium alginate hydrogel encapsulation technique during the zebrafish ovarian tissue vitrification procedure. In Experiment 1, were evaluated the encapsulation form (immersion or 30 μL alginate bead), the moment of exposure to vitrification solution (before or after encapsulation) and the warming temperature (28, 37 and 50 oC) and was evaluated the membrane integrity by trypan blue stain. Data showed that ovarian tissue encapsuled by immersion, exposed to vitrification solution after encapsulation and warmed at 28oC, had higher membrane integrity of all oocyte developmental stage (PG: 37.71 ± 3.86 %; CA: 29.93 ± 4.18 %; Vtg1: 18.61 ± 4.69 %) and was used in Experiment 2. In Experiment 2 were evaluated four vitrified groups (VS: 1.5M Methanol + 5.5M Me2SO + 0.5M sucrose; VS1-A: 1.5M Methanol + 5.5M Me2SO + 0.5M sucrose – encapsulated in alginate; VS2-A: 0.75M Methanol + 2.75M Me2SO + 0.25M sucrose – encapsulated in alginate; VA: encapsulated in alginate) and were evaluated the membrane integrity (SYBR-14/PI), morphology (histology – HE), mitochondrial activity (MTT), and lipid peroxidation (TBARS). The VA treatment showed a lower percentage of membrane integrity, while VS demonstrated a higher membrane integrity in which it did not differ from the VS1-A treatment. Mitochondrial activity was greater in the non- encapsulated treatment (VS) and the encapsulated treatments had less value. The VA treatment obtained the highest level of lipid peroxidation, while VS1-A and VS obtained the lowest values in which VS was not different from the VS2-A treatment. The results obtained in this study demonstrate that the sodium alginate hydrogel encapsulation technique did not have a cryoprotective action and did not allow the reduction of the CPA concentration. However, the encapsulation of the fragments of ovarian tissue in alginate hydrogel, enabled support and prevented loss of cells during the vitrification process.