Uma estratégia funcional para a caracterização de OsbHLH35 e OsGRF11 no desenvolvimento de arroz

Abstract

O arroz (Oryza sativa L.) é extremamente versátil, é planta modelo das monocotiledôneas, seu grão é base alimentar de milhões de pessoas ao redor do mundo, e é amplamente cultivado, agregando valor econômico e social à cultura. As proteínas do tipo bHLH (basic helix-loop-helix) são membros de uma das maiores famílias de fatores de transcrição em plantas e participam da regulação de uma grande variedade de processos. Para entender a função de um membro desta família, foi realizado um ensaio de mono-híbrido em levedura, que permitiu identificar três membros da família GRF (Growth Regulating Factor), OsGRF3, OsGRF4 e OsGRF11, como reguladores transcricionais do gene OsbHLH35. A fim de fornecer informações adicionais sobre a função de OsbHLH35 e para confirmar a regulação de OsGRF11 sobre OsbHLH35 in vivo, plantas de arroz superexpressando os genes separadamente foram previamente obtidas através de transformação de calos embriogênicos de arroz via Agrobacterium tumefaciens. Quatro linhagens de OsbHLH35 e sete de OsGRF11 foram obtidas e analisadas molecularmente através da análise da expressão relativa dos genes OsbHLH35 e OsGRF11 que confirmou a superexpressão dos genes de interesse. A análise fenotípica das plantas superexpressando OsbHLH35 mostrou que essas plantas produziam significativamente menor número de sementes que as plantas não transformadas, além de apresentarem fenótipo de pálea e lema abertas, flores não fecundadas e poucas sementes maduras. Ao realizar uma análise detalhada da flor, foram observadas anteras com aspecto curvo. Para abordar em quais tecidos OsbHLH35 é expresso, um estudo do promotor foi realizado em plantas de arroz expressando o gene repórter da β-glucuronidase sob o controle do promotor de OsbHLH35. Através dessa abordagem observou-se a expressão de OsbHLH35 na antera, nos primórdios florais, na pálea e lema, e no ovário. A análise da expressão relativa de OsGRF11 e OsbHLH35 ao longo do desenvolvimento da panícula em plantas do tipo selvagem mostrou que OsGRF11 é altamente expresso em todos os estágios de desenvolvimento analisados, enquanto a expressão de OsbHLH35 é baixa nas mesmas condições. Entender como OsbHLH35 está envolvida no desenvolvimento da antera, quais são os genes regulados por esse fator de transcrição, e como é sua relação com outras bHLHs permitirá elucidar onde este gene está inserido no processo de desenvolvimento floral de arroz.

Rice (Oryza sativa L.) is not only a monocotyledonous model plant, but also a food base for millions of people, and is widely cultivated having social and economic importance. Basic helix-loop-helix (bHLH) proteins are members of one of the largest families of transcription factors in plants and participate in the regulation of a wide variety of processes. To understand the role of one member of this family, a yeast monohybrid assay was performed which identified three members of the Growth Regulating Factor (GRF) family, OsGRF3, OsGRF4 and OsGRF11, as transcriptional regulators of the OsbHLH35 gene. In order to provide additional information on OsbHLH35 function and to confirm the regulation of OsGRF11 on OsbHLH35 in vivo, rice plants overexpressing the genes separately were obtained previously by transformation of embryogenic rice calli via Agrobacterium tumefaciens. Four lines of OsbHLH35 and seven lines of OsGRF11 were obtained and molecularly analyzed. Analysis of relative expression of the OsbHLH35 and OsGRF11 genes confirmed overexpression of these genes. Phenotypic analysis of plants overexpressing OsbHLH35 showed that these plants produced significantly fewer seeds than untransformed plants, besides presenting open palea and lemma phenotype, nonfertilized flowers and few mature seeds. When performing a detailed analysis of the flower, curved anthers were observed. To address which tissues OsbHLH35 are expressed, a promoter study was performed on rice plants expressing the β-glucuronidase reporter gene under the control of the OsbHLH35 promoter. Through this approach, the expression of OsbHLH35 was observed in the anther, floral primordia, palea and lemma, and in the ovary. Analysis of the relative expression of OsGRF11 and OsbHLH35 throughout panicle development in wild type plants showed that OsGRF11 is highly expressed at all developmental stages analyzed, while OsbHLH35 expression is low under the same conditions. Understanding how OsbHLH35 is involved in anther development, which genes are regulated by this transcription factor, and how it relates to other bHLHs will allow us to clarify where this gene is inserted in the floral development process of rice.