Avaliação imunobioquímica de células com diferentes perfis de ciclagem em leucemias agudas

Abstract

Alterações relevantes como: reprogramação metabólica, mudança no perfil de expressão gênica, proteica e interação com células do sistema imune são observadas nas células precursoras mieloides e linfoides presentes na medula óssea, como a Leucemia Mieloide Aguda (LMA) e a Leucemia Linfocítica Aguda (LLA-B). Dessa forma, é necessário investigar formas de identificar e atingir as células que são consideradas as maiores responsáveis pela resistência e recorrência, dentre as diferentes populações neoplásicas. Por isso, neste projeto, propusemos a avaliação de características do metabolismo e de diversos marcadores de células slow-cycling ou marcadores de Leukemia Stem Cells (LSCs). Primeiramente, analisamos dados de expressão gênica disponíveis publicamente de pacientes de LMA e LLA-B, onde comparamos a expressão de diversos marcadores associados com as LSCs e as células slow-cycling em amostras recorrentes de medula e amostras primárias de medula. Observamos um enriquecimento de expressão de genes da assinatura de LSCs e células slow-cycling nas amostras recorrentes, assim como identificamos grupos de genes, diferentes para LLA-B e LMA, que apresentam potencial como biomarcadores de LSCs ou células slow-cycling e para detecção da Doença Residual Mínima (DRM). Além disso, observamos conjuntos de vias enriquecidas nas amostras recorrentes que podem indicar processos metabólicos relevantes para a persistência de células leucêmicas após o tratamento. Em seguida, analisamos amostras de medula de pacientes com LMA ou LLA-B no momento do diagnóstico e no momento da primeira avaliação da DRM. As análises foram realizadas antes e após o tratamento dos pacientes de forma a identificar possíveis alterações nas populações celulares mediante tratamento. Esta abordagem permitiu uma análise única sobre as populações tumorais de cada paciente e como elas respondem ao tratamento. Adicionalmente, a análise dos resultados estratificados de acordo com o risco designado no momento do diagnóstico possibilitou a visualização de diferentes perfis entre os pacientes, que, eventualmente, podem contribuir para estratégias de alocação de risco e prognóstico. Analisamos a expressão gênica de um conjunto de genes de interesse por estarem envolvidos em vias metabólicas e processos biológicos relevantes aos fenótipos slow-cycling e de LSCs e observamos diferenças de expressão entre diagnóstico e DRM, a maioria dos genes analisados apresentou aumento de expressão na DRM. Realizamos uma análise populacional dos blastos dos pacientes de LLA-B e LMA por imunofenotipagem, observando a expressão de marcadores de interesse e de checkpoints imunes. As populações mais imaturas de blastos (CD34+) apresentaram maior expressão dos marcadores analisados, em geral. Também observamos a expressões de checkpoints imunes em populações de células imunes (monócitos, linfócitos e neutrófilos) destes mesmos pacientes, quando possível. Por fim, observamos características do metabolismo das células nestas amostras, antes e após o tratamento, em relação à glicólise, metabolismo de ácidos graxos, fosforilação oxidativa. Também observamos a capacidade de quimiorresistência diferencial entre células slow- e fast-cycling. O entendimento do funcionamento diferencial das LSCs e das células slow-cycling em relação às outras populações de células leucêmicas é crucial não apenas para encontrar tratamentos que as atinjam especificamente, como também para identificá-las propriamente, com as ferramentas atuais de diagnóstico, além de abrir caminho para novos alvos de tratamento que compreendem a complexidade da heterogeneidade tumoral.

Relevant alterations such as: metabolic reprogramming, changes in gene and protein expression profile and interaction with immune system cells are observed in myeloid and lymphoid precursor cells present in the bone marrow, in Acute Myeloid Leukemia (AML) and Acute Lymphocytic Leukemia (ALL-B). Thus, it is necessary to investigate ways to identify and target the cells that are considered responsible for resistance and recurrence, among the different neoplastic populations. Therefore, in this project, we proposed the evaluation of metabolic characteristics and of several slow-cycling cell markers or Leukemia Stem Cells (LSCs) markers. First, we analyzed publicly available gene expression data from AML and ALL-B patients, where we compared the expression of several markers associated with LSCs and slowcycling cells in recurrent bone marrow samples and primary bone marrow samples. We observed an enrichment of gene expression signature of LSCs and slow-cycling cells in the recurrent samples, as well as identified groups of genes, different for ALL-B and AML, that have potential as biomarkers for LSCs or slow-cycling cells and for detection of Minimal Residual Disease (MRD). Furthermore, we observed sets of enriched pathways in the recurrent samples that may indicate metabolic processes relevant to the persistence of leukemic cells after treatment. We then analyzed bone marrow samples from patients with AML or B-ALL at the time of diagnosis and at the time of the first MRD assessment. Analyses were performed before and after treatment of patients in order to identify possible changes in cell populations upon treatment. This approach allowed for a unique analysis of each patient's neoplastic populations and how they respond to treatment. Additionally, the analysis of results stratified according to the risk assigned at the time of diagnosis made it possible to visualize different profiles among patients, which, eventually, may contribute to risk allocation and prognosis strategies. We analyzed the gene expression of a set of genes of interest because they are involved in metabolic pathways and biological processes relevant to slow-cycling and LSCs phenotypes and we observed differences in expression between diagnosis and MRD, most of the analyzed genes showed increased expression in MRD. We performed a population analysis of blasts from BALL and AML patients by immunophenotyping, observing the expression of markers of interest and immune checkpoints. The most immature populations of blasts (CD34+) showed higher expression of the analyzed markers, in general. We also observed the expression of immune checkpoints in populations of immune cells (monocytes, lymphocytes and neutrophils) from these same patients, when possible. Finally, we observed characteristics of cell metabolism in these samples, before and after treatment, in relation to glycolysis, fatty acid metabolism and oxidative phosphorylation. We also observed differential chemoresistance between slow- and fast-cycling cells. Understanding the differential functioning of LSCs and slow-cycling cells in relation to other leukemic cell populations is crucial not only to find treatments that specifically target them, but also to identify them properly, with current diagnostic tools, in addition to pave the way for new treatment targets that comprehend the complexity of tumor heterogeneity.