Caracterização molecular e funcional do gene AT1G52200 (AtPLAC8-11.1) de Arabidopsis thaliana

Abstract

A morte celular programada (do inglês, Programmed Cell Death) é um processo geneticamente controlado que provoca o suicídio celular em organismos eucarióticos e procarióticos. A PCD ocorre em plantas durante seu desenvolvimento e quando expostas a diferentes condições de estresses caracterizados por estresses abióticos e bióticos. Diversos estudos foram realizados para entender os mecanismos relacionados à PCD em plantas, utilizando principalmente Arabidopsis thaliana. Recentemente, uma rede chamada "deathosome LSD1" foi sugerida em Arabidopsis e mostra as interações entre os reguladores de morte celular conhecidos, como o LSD1 (Lesion Simulating Disease 1), um gene central nessa rede, e seus parceiros de interação. O gene At1g52200 que codifica uma proteína do motivo PLAC8 (placent specific 8) foi descrito como componente dessa rede, mas sua função não foi estudada até o momento. O objetivo geral deste trabalho é estudar AtPLAC8-11.1 e verificar a existência do transcrito alternativo AtPLAC8-11.2 previsto in silico. Para isso, os insertos amplificados a partir de cDNA de A. thaliana, AtPLAC8-11.1 e AtPLAC8-11.2 foram clonados no vector de entrada pENTR/D-TOPO, e o AtPLAC8-11.1 foi subclonado em vetores binários de destino. Plantas transgênicas de Arabidopsis superexpressando AtPLAC8-11.1 foram geradas via floral dipping. Além disso, via banco de sementes Arabidopsis Stock Center (ABRC), linhagens mutantes knockdown e knockout para AtPLAC8-11.1, com inserção de T-DNA no promotor e primeiro éxon do gene, respectivamente foram adquiridas e genotipadas. As plantas knockout plac8-11.1 apresentaram maior comprimento de raiz, quando comparado ao tipo selvagem, indicando um possível papel deste gene no desenvolvimento radicular. Nossos resultados mostraram a existência de AtPLAC8-11.2, no entanto, o nível de transcritos é baixo na parte aérea de Arabidopsis, quando comparado ao AtPLAC8-11.1. Estudos preliminares indicam a localização subcelular de AtPLAC8-11.1 na membrana plasmática e eventual reciclagem por vesículas secretoras. Dificuldades na fase de seleção de plantas de Arabidopsis transformadas contendo a construção para super-expressão de AtPLAC8-11.1 indicam a possibilidade de que altos níveis transcricionais de AtPLAC8-11.1 possam ser prejudiciais à planta, especialmente em condições de estresse. Estes resultados indicam o envolvimento de AtPLAC8-11.1 no processo de PCD em Arabidopsis.

Programmed Cell Death (PCD) is a genetically controlled process triggering cellular suicide in both eukaryotic and prokaryotic organisms. PCD occurs in plants during their development and when exposed to different stress conditions characterized by abiotic and biotic stresses. Several studies were performed to understand the mechanisms related to PCD in plants, mainly using Arabidopsis thaliana. Recently, a network called deathosome LSD1 has been suggested in Arabidopsis and it shows the interactions between known cell death regulators such as LSD1 (Lesion Simulating Disease 1), a central gene in this network, and their interaction partners. The At1g52200 gene encoding a PLAC8 (placent specific 8) motif was described as a component of this network, but its function has not yet been characterized. The general objective of this work is to study AtPLAC8-11.1 and verify the existence of the alternative transcript AtPLAC8-11.2 predicted in silico. For this, the inserts amplified from A. thaliana cDNA, AtPLAC8-11.1 and AtPLAC8-11.2, were cloned into the pENTR/D-TOPO entry vector, and AtPLAC8-11.1 was subcloned into binary destination vectors. Arabidopsis transgenic plants overexpressing AtPLAC8-11.1 were generated via floral dipping. In addition, via the Arabidopsis Stock Center (ABRC) seed bank, mutant knockdown and knockout for AtPLAC8-11.1, with insertion of T-DNA into the promoter and the first exon of the gene, were respectively acquired and genotyped. The plac8-11.1 knockout plants presented increased root lenght, when compared to wild type, indicating a possible role of this gene in root development. Our results showed the existence of AtPLAC8-11.2, however, the level of transcripts are low in Arabidopsis shoots, when compared to AtPLAC8-11.1. Preliminary studies indicate the subcellular localization of AtPLAC8-11.1 in the plasma membrane and with possible recycling by secretory vesicles. Difficulties in the selection phase of transformed Arabidopsis plants containing the construct for overexpression of AtPLAC8-11.1 indicate the possibility that high transcriptional levels of AtPLAC8-11.1 may be detrimental to the plant, especially under stress conditions. These results indicate the involvement of AtPLAC8-11.1 in the PCD process in Arabidopsis.