Papel dos fatores de crescimento e diferenciação (GDF) 8, 11 e 15 na perda muscular em modelo de artrite experimental

Abstract

Introdução: A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória autoimune, a qual acomete primordialmente as articulações sinoviais periféricas. Além disso, os pacientes com AR também apresentam manifestações extra-articulares, como a perda de massa muscular. Os componentes da superfamília do fator de crescimento transformador beta (TGF-β) apresentam função importante na modulação da massa muscular como os fatores de crescimento e diferenciação (GDFs). Os fatores de crescimento e diferenciação 8 e 11 (GDF-8, GDF-11) já foram reportados como reguladores negativos da massa muscular por diversos mecanismos, como por exemplo, a indução de GDF-15, levando à alteração do apetite e da homeostase energética. Objetivo: Avaliar os níveis séricos e musculares da expressão gênica e proteica de GDF-8, GDF-11 e GDF-15 durante o desenvolvimento da artrite induzida por colágeno (CIA) e sua associação com o declínio físico. Métodos: Camundongos DBA1/J, machos, com 8-12 semanas de idade, foram randomizados em 5 grupos experimentais: animais saudáveis (BL n=6); animais controle avaliados nos dias 25 e 50 (CO 25 = 8, CO 50 = 8); animais com artrite induzida por colágeno avaliados nos dias 25 e 50 (CIA 25 = 8; CIA 50 = 8). Durante todo o período experimental do modelo de CIA foram avaliados 3 vezes por semana: escore clínico, edema das patas e peso corporal. Força de preensão, nocicepção, tempo de fadiga e velocidade de marcha foram avaliados nos 5 grupos experimentais nos dias 0, 18, 25, 50 de experimentação. O músculo TA foi usado para medir a área da seção transversal da miofibra (CSA) e o músculo GA foi utilizado para avaliar a expressão gênica de GDF-8, GDF-11 e GDF-15 via reação de polimerase reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). A expressão da proteica de GDF-8, GDF-11 no soro e no músculo GA foi realizada por meio de Enzima-Ligado de imunoabsorção (ELISA). Os testes estatísticos utilizados foram: ANOVA de duas vias seguido por teste de Bonferroni, ANOVA de uma via seguido por teste de Bonferroni, teste de equação de estimativa generalizada (GEE) seguido de Bonferroni, teste U de Mann Whitney, teste de Kruskall Wallis seguido por teste de Dunn, teste de modelo linear misto (LMM). Os resultados foram considerados significativos quando p<0.05. Resultados: O desenvolvimento da AR nos grupos CIA inicial e CIA estabelecido foi confirmado por valores significativamente altos de escore clínico, nocicepção, edema da pata e escore histológico 6 quando comparado com os respectivos controles (p<0,0001; p=0,001; p= 0,001, respectivamente). Houve diminuição de força de preensão no grupo CIA 25 e CIA 50, em comparação com os controles CO 25 e CO 50 (p= 0,0021, p=0,007, respectivamente). O tempo de fadiga foi menor em CIA 25 e CIA 50 comparado aos controles (p = 0,002, p= 0,006, respectivamente). A velocidade de marcha apresentou diminuição em CIA 25 comparado ao CO 25 (p=0,001) e em CIA 50 comparado ao CO 50 (p=0,000). O peso dos músculos GA e TA apresentaram diminuição apenas no modelo CIA 50 (-34,77% e -42,74% respectivamente); após normalização pelo peso corporal, apenas o músculo GA apresentou redução significativa no grupo CIA estabelecido quando comparado ao CO 50 (-34,5 %). A área da miofibra do músculo TA apresentou redução de 14,04% no grupo CIA 50 em comparação com o CO 50 (p=0,026). Não houve alterações em relação ao peso corporal. O nível de mRNA de GDF-15 não diferiu entre os grupos. A análise de GDF-11 revelou aumento dos níveis de mRNA no músculo GA do grupo CIA 25 em comparação com o CO 25 e com grupo BL (p=0,004; p = 0,0087, respectivamente); em CIA 50, houve uma tendência de aumento dos níveis de mRNA de GDF-11em relação ao CO 50 (p=0,07). No músculo GA, a expressão proteica de GDF-11 apresentou diferenças entre o grupo CIA 25 e CO 25 (p=0,002) e nos grupos CIA 50 e CO 50 (p=0,017), porém, a expressão proteica de GDF-11 no soro dos animais não apresentou diferenças entre os grupos analisados. A expressão gênica de GDF-8 apresentou diminuição no musculo GA do grupo CIA 50 em comparação ao CO 50 e apresentou diferenças entre dos grupos CIA 25 e CIA 50 (p= 0,010; p= 0,0369, respectivamente); O músculo GA teve uma expressão proteica diminuída de GDF-8 entre os grupos CIA 25 e CIA 50 (p = 0,001) e, no soro os níveis proteicos de GDF-8 apresentaram diminuição em CIA 50 em comparação com o CO 50 (p = 0,037). A baixa força muscular foi associada a maiores níveis de proteína GDF-11 no músculo GA (r = -0,64; p = 0,01) e diminuição da velocidade de marcha (r = -0,534; p = 0,04). Níveis séricos mais elevados de GDF-8 foram associados a maior força muscular (r = 0,74; p = 0,02) e aumento da velocidade de caminhada (r = 0,64; p = 0,01). Conclusões: No presente estudo, foi observado o declínio da função física em estágios iniciais da artrite experimental antes de se identificar atrofia muscular, e o aumento de GDF-11 no músculo está associado à piora da função, enquanto que há diminuição de GDF- 8 no soro de animais CIA 50 e aumento dos 7 níveis proteicos de GDF-8 no músculo de animais CIA ao longo do tempo, o que pode significar um papel mais sistêmico do GDF-8 no modelo da CIA. Tomando nossos resultados em conjunto, sugere-se que a família TGF-β, especialmente GDF-8 e 11, podem estar envolvidos na perda de massa, força e função do músculo esquelético em modelo experimental de AR.

Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune inflammatory disease, which primarily affects peripheral synovial joints. In addition, patients with RA also have extra-articular manifestations, such as loss of muscle mass. The components of the transforming growth factor beta superfamily (TGF-β) play an important role in muscle mass regulation as growth and differentiation factors (GDFs). Growth and differentiation factors (GDF) 8 and 11 have already been reported as negative regulators of muscle mass by several mechanisms, such as the induction of GDF-15, leading to changes in appetite and energy homeostasis. Objective: To evaluate serum and muscle levels of gene and protein expression of GDF-8, GDF-11 and GDF-15 during the development of collagen-induced arthritis (CIA) and its association with physical decline. Methods: Male DBA1/J mice, 8-12 weeks old, were randomized into 5 experimental groups: healthy baseline animals (BL=6); control animals evaluated at days 25 and 50 (CO25=8, CO50=8) and collagen-induced arthritis mice evaluated at day 25 and 50 (CIA 25=8; CIA 50=8). During the entire experimental period of the CIA model, the following tests were performed 3 times a week: clinical score, paw edema and body weight. Grip strength, nociception, fatigue time and walking speed were taken in the 5 experimental groups on days 0, 18, 25, 50 of experimentation. The TA muscle was used to measure the cross-sectional area of the myofiber (CSA) and GA muscle was used to assess the gene expression of GDF-8, GDF-11 and GDF-15 via real-time quantitative reverse polymerase reaction (qRT-PCR). Protein expression of GDF-8, GDF-11 in serum and GA muscle was performed via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The statistical tests used were two-way ANOVA followed by Bonferroni test, one-way ANOVA followed by Bonferroni test, generalized estimating equation (GEE) test followed by Bonferroni, Mann Whitney U test, Kruskall Wallis test followed by Dunn's test and mixed linear model test (LMM). Significance was reached when p < 0.05. Results: The development of RA in the CIA 25 and CIA 50 groups was confirmed by increased values of clinical score, nociception, paw edema and histological score when compared to controls (p <0.0001; 9 p = 0.001; p = 0.001, respectively). Decreased grip strength was observed in the CIA 25 and CIA 50 groups when compared to CO 25 and CO 50 (p = 0.0021, p = 0.007, respectively). Fatigue time was shorter at CIA 25 and CIA 50 compared to the controls (p = 0.002, p = 0.006, respectively). Walking speed was reduced at CIA 25 compared to CO 25 (p = 0.001) and at CIA 50 compared to CO 50 (p = 0.000). The weight of the GA and TA muscles decreased only in the CIA 50 model (-34.77% and -42.74% respectively); after normalization by body weight, only the GA muscle maintained the reduction in the CIA 50 group when compared to the CO 50 (-34.5%). The TA CSA presented a reduction of 14.04% in the CIA 50 group compared to the CO 50 group (p = 0.026). There were no changes regarding body weight or mRNA levels ofGDF-15 between groups. Analysis of GDF-11 revealed increased mRNA levels in the muscle of the CIA 25 group compared to the CO 25 and BL group (p = 0.004; p = 0.0087, respectively); at CIA 50, there was a trend towards increased levels of GDF-11 mRNA in relation to CO 50 (p= 0.07). Protein expression of GDF-11 in animal serum did not differ between groups; however, in GA muscle, protein expression of GDF-11 presented differences between the CIA 25 and CIA 50 compared with the respective controls (p = 0.002; p = 0.017, respectively). The gene expression of GDF-8 showed a decrease in the muscle of the CIA 50 group compared to the CO 50 and differences between the CIA 25 and CIA 50 groups (p = 0.010; p = 0.0369, respectively); The GA muscle had a decreased expression of the GDF-8 protein between the CIA 25 and CIA 50 groups (p= 0.001), while serum levels of GDF-8 were decreased in CIA 50 compared with CO 50 (p= 0.037). Low muscle strength was associated with higher levels of GDF-11 protein in the GA muscle (r= -0.64; p = 0.01) and decreased walking speed (r= -0.534; p= 0.04). Higher serum GDF-8 levels were associated with greater muscle strength. Conclusion: In the present study, a decline in physical function in early stages of experimental arthritis was observed before muscle wasting was identified, and an increase in muscle GDF-11 is associated with worsening of function, while there is a decrease in serum GDF-8 of CIA animals and increased protein levels of GDF-8 in muscle of CIA animals over time, which may imply a more systemic role of GDF-8 in the CIA model. Taking our results together, it is suggested that the TGF-β 10 family, especially GDF-8 and 11, may be involved in the loss of skeletal muscle mass, strength and function in an experimental model of RA.