Controle de qualidade de besifloxacino em suspensão oftálmica : metodologia analítica, estudo preliminar de estabilidade, citotoxicidade

Abstract

O presente trabalho relata o desenvolvimento e validação de metodologia analítica para determinação de besifloxacino (BSF) em suspensão oftálmica, bem como estudo preliminar de estabilidade, cinética de degradação e citotoxicidade. O ensaio microbiológico de difusão em ágar- método de cilindros em placa foi realizado com Staphylococcus epidermidis ATCC12228 como microrganismo teste. Apresentou resultados satisfatórios, com especificidade, linearidade na faixa de 0,5 a 2,0 μg mL-1, precisão, exatidão, e robustez. Soluções de BSF do produto acabado expostas à radiação UVA (352nm) e soluções placebo da formulação foram utilizadas para avaliar a especificidade do bioensaio. A robustez do método foi avaliada variando a concentração de microrganismo na camada inoculada. O desenvolvimento e validação de método por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi verificado através da especificidade, linearidade, precisão, exatidão e robustez. No método cromatográfico foi utilizada coluna Agilent® Eclipse Plus C18, fase móvel constituída por 0,5% de trietilamina (pH 3,0) e acetonitrila (74:26 v/v). O método apresentou-se específico, linear, no intervalo de 20 a 80μg/mL, preciso, exato e robusto. Os métodos microbiológico e CLAE validados foram comparados estatisticamente e verificou-se não haver diferença significativa entre eles. No estudo preliminar de estabilidade constatou-se estabilidade frente à degradação térmica no período avaliado e instabilidade frente à fotodegradação. Pôde-se sugerir que os excipientes presentes na formulação protegeram a substância ativa frente à radiação UV. A cinética de degradação, frente à radiação UVA, mostrou que as amostras de BSF seguem reação de primeira ordem enquanto que a SQR apresenta reação de segunda ordem. O ensaio de citotoxicidade demonstrou que nas concentrações testadas, independentemente se houve ou não degradação à luz UVA, o BSF não alterou a membrana celular, sendo considerado não tóxico às células mononucleares humanas nas condições analisadas.

This paper describes the development and validation of analytical methodology for determination of besifloxacin (BSF) ophthalmic suspension, a preliminary stability study, degradation kinetics and cytotoxicity evaluation. The agar diffusion cylinder plate method microbiological assay was performed with Staphylococcus epidermidis ATCC12228 as test microorganism. It showed excellent results including specificity, linearity in the range of 0.5 to 2.0 g mL-1, precision, accuracy, and robustness. Solutions of BSF drug product exposed to UVA (352nm) and placebo solutions containing only excipients in the formulation, were use to evaluate the specificity of the bioassay. The robustness of the method was evaluated by varying the concentration of microorganism in the layer inoculated. The method by high performance liquid chromatography (HPLC) was validated through specificity, linearity, accuracy, precision and robustness analysis. The column chromatographic method used Agilent Eclipse Plus ® C18, mobile phase consisting of 0.5% triethylamine (pH 3.0) and acetonitrile (74:26 v / v). The method proved to be specific, linear in the range from 20 to 80μg mL-1, precise, accurate, and robust. The microbiological and HPLC validated methods were compare statistically and no significant difference between them was found. In the stability study, it was evidenced a stable towards thermal degradation during the evaluation period and instability against photodegradation. It can be concluded that the excipients present in the formulation protected the active principle against UV radiation. The kinetics of degradation front UVA radiation showed that solutions of drug product follow first-order reaction, while BSF RS follow second-order reaction. Cytotoxicity evaluation demonstrated that, at all concentrations tested, regardless whether or not the degradation UVA light, the BSF does not alter the cell membrane, considered non-toxic to human mononuclear cells.