Achyrobichalcona obtida a partir de Achyrocline satureioides (lam.) DC. Asteraceae : isolamento, caracterização, complexação com ciclodextrina e avaliação da atividade antitumoral

Abstract

Achyrobichalcona (ACB), objeto de estudo desta tese, é um biflavonoide recentemente encontrado em Achyrocline satureioides. O objetivo inicial deste trabalho voltou-se ao isolamento da ACB a partir de um extrato hidroalcoólico de A. satureioides. Para tanto, um método semi-preparativo utilizando cromatografia em contracorrente de alta velocidade foi desenvolvido. O isolamento foi realizado em duas etapas: 1) obtenção de frações enriquecidas em ACB provenientes do fracionamento do extrato; e 2) isolamento da ACB a partir destas frações enriquecidas. A separação foi realizada utilizando-se um sistema bifásico de solventes: hexano-acetato de etila-metanol-água, nas proporções 0.8:1:0.8:1, (v/v) para a primeira etapa e 0.9:0.9:0.8:1, (v/v) para a segunda etapa. O produto resultante foi purificado, cristalizado, identificado e o seu estado sólido caracterizado. O método resultou na obtenção de ACB com bom rendimento (67%) e pureza (próximo à 90%) para uso em estudos posteriores. Um método indicativo de estabilidade por cromatografia líquida de alta eficiência foi desenvolvido com o objetivo de avaliar todos os lotes de ACB isolada. Os parâmetros cromatográficos foram otimizados com o auxílio do desenho experimental Box- Behnken, gerando o sistema cromatográfico ideal para a quantificação da ACB: 37% de acetonitrila na fase móvel (63% de água/ácido ortofosfórico 1%), fluxo da fase móvel de 1,2 mL/min e 33°C de temperatura da coluna. O estudo revelou que a resolução entre impurezas e o pico da ACB e o fator de retenção foram significativamente alterados quanto os parâmetros cromatográficos foram variados. O modelo mostrou-se adequado e com boa capacidade preditiva. O método foi validado com sucesso, sendo linear, específico, exato e preciso. A robustez foi avaliada pelo desenho Plackett-Burman, demonstrando que o comprimento de onda de detecção e fluxo da fase móvel devem ser rigorosamente controlados, pois influenciam na concentração da ACB. A ACB foi instável apenas em meio alcalino; sua reação de degradação obedeceu a uma cinética de segunda ordem. A etapa seguinte objetivou avaliar comparativamente as propriedades antitumorais apresentadas por ACB, A. satureioides e outros flavonoides presentes na planta: quercetina (QCT), luteolina (LUT) e 3-O-metilquercetina (3OMQ). Primeiramente, uma revisão sobre esse tema foi elaborada com o objetivo de compilar as principais informações descritas na literatura a respeito das atividades quimioterapêuticas demonstradas para QCT, LUT, 3OMQ e A. satureioides. Subsequentemente, desenvolveu-se um estudo experimental para avaliar as propriedades antitumorais de um extrato de A. satureioides (EXT) e de seus principais flavonoides, isoladamente ou combinados na mesma proporção encontrada no EXT, frente à A549, uma linhagem de câncer de pulmão de nãopequenas células. A citotoxicidade do complexo ACB:hidroxipropil-β-ciclodextrina também foi avaliada para a A549. Os resultados demonstraram que tanto EXT (IC50%: 49 μg/mL) quanto seus flavonoides foram muito citotóxicos para a A549 (IC50%: 3OMQ-7,3 μM>ACB-13,5 μM>LUT-14,6 μM>QCT-51,1 μM), especialmente 3OMQ e ACB, avaliadas pela primeira vez em uma linhagem de câncer de pulmão. O estudo revelou que os flavonoides foram as únicas substâncias responsáveis pela citotoxicidade do extrato. A complexação entre ACB:HPβCD resultou em um grande incremento na solubilidade aquosa da ACB e aumento na citotoxicidade frente à A549 (IC50%: 9,15 μM). Todas as amostras causaram morte celular por indução da apoptose, sendo que para algumas delas a via extrínseca foi ativada (3OMQ, ACB e EXT). Sendo assim, o estudo demonstrou que A. satureioides e seus flavonoides são promissores agentes antitumorais e que a complexação com ciclodextrinas pode representar uma estratégia tecnológica importante no intuito de melhorar as propriedades físico-químicas e biológicas de moléculas bioativas.

Achyrobichalcone (ACB), object of study of this thesis, is a biflavonoid recently found in Achyrocline satureioides. The initial objective of this work aimed at ACB isolation from an A. satureioides hydroalcoholic extract. For this purpose, a semi-preparative method by high-speed countercurrent chromatography (HSCCC) was developed. The isolation was achieved in two steps: 1) obtaining ACB enriched fractions from the fractioning of the extract; and 2) ACB separation from these enriched fractions. The separation was obtained using a biphasic solvent system: hexane-ethyl acetatemethanol- water, at proportions 0.8:1:0.8:1 (v/v) for the first step and 0.9:0.9:0.8:1 (v/v) for the second step. The resulting product was purified, crystallized, identified and the solid state was characterized. The method resulted in ACB in good yield (67%) and purity (about 90%) for use in further studies. A stability-indicating high performance liquid chromatographic method was developed in order to evaluate all batches of ACB isolated. The chromatographic parameters were optimized by Box- Behnken design, providing the ideal chromatographic system for ACB quantification: 37% of acetonitrile on the mobile phase (63% water/orthophosphoric acid 1%), flow rate of the mobile phase of 1.2 ml/min and 33°C of column temperature. The resolution between impurities and ACB peak and retention factor were significantly changed when chromatographic parameters were altered. The model was suitable, with good predictive capacity. The method was successful validated, being linear, specific, accurate and precise. Plackett-Burman robustness test demonstrated that detection wavelength and flow rate of mobile phase must be strictly controlled because influenced ACB concentration. ACB was unstable only in alkaline medium, and the degradation reaction was guided by a second-order kinetics. The next step aimed a comparative evaluation of the anticancer properties of ACB, A. satureioides extract and others flavonoids present in the plant: quercetin (QCT), luteolin (LUT) and 3-O-methylquercetin (3OMQ). Firstly, a review of this theme was performed to compile the main information described in literature about chemotherapeutics activities of QCT, LUT, 3OMQ and A. satureioides. Subsequently, an experimental study was carried out to evaluate the anticancer properties of an A. satureioides extract (EXT) and its major flavonoids alone or combined in the same proportion found in EXT, against A549, a non-small cancer lung cell line (NSCLC). In addition, the cytotoxicity of a ACB:hydroxipropil-β-cyclodextrin (ACB:HPβCD) complex was also assessed for A549. The results showed that both EXT (49 μg/mL) as its flavonoids were highly cytotoxic for A549 (GI50%: 3OMQ-7.3 μM>ACB-13.5 μM>LUT-14.6 μM>QCT-51.1 μM), especially 3OMQ and ACB, evaluated for the first time against lung cancer. The study showed that flavonoids were the unique substances responsible for the cytotoxicity of the extract. ACB:HPβCD complex allowed a great enhance in water solubility of ACB and cytotoxicity against A549 (GI50%: 9.15 μM). All the samples induced cell death by apoptosis induction, and for some of them the extrinsic pathway was activated (3OMQ, ACB and EXT). Taken together, the study demonstrated that A. satureioides and its derived flavonoids are promising anticancer agents and, additionally, the cyclodextrin complexation can represent an important technological strategy for improve physicochemical and biological properties of bioative molecules.