Nanoemulsões como sistemas de liberação de oligonucleotídeos anti-topoisomerase II de plasmodium falciparum

Abstract

The present study describes the technological, physicochemical and biological aspects of complexes formed between cationic nanoemulsions and oligonucleotides (ON) targeted toward Plasmodium falciparum topoisomerase II. Formulations were optimized by means of a 23 full factorial design. Two formulations composed of medium-chain triglycerides, egg yolk lecithin and either oleylamine or DOTAP cationic lipids were selected based on their physicochemical properties. Phosphodiester or phosphorothioate ONs were adsorbed onto cationic nanoemulsions. The adsorption isotherms indicated a progressive ON adsorption until a plateau was reached, following a Langmuir adsorption model. It was observed that a higher amount of ON was adsorbed onto the DOTAP-based nanoemulsions compared to those based on oleylamine. Further evidence of ON adsorption was obtained through the inversion of the zeta potential. Topographical and morphological analysis of the complexes, by transmission electron and atomic force microscopy, indicated ON adsorption onto the nanoemulsions. Strucutural organization in a lamellar phase was also identified by energy dispersive X-ray diffraction. ON binding and hemolysis increased along with the charge ratio of the complexes in healthy or Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Fluorescent probes co-encapsulated into the complexes (fluorescein and Nile red) were located inside the infected erytrocytes at the late stages of the parasite life cycle by confocal microscopy. Under non-hemolytic conditions, Plasmodium falciparum growth inhibition effect of around 80% and a delay in the parasite life cycle were observed in vitro. The overall results showed that the use of ON/cationic nanoemulsions complexes may represent a promising strategy for the treatment of P. falciparum infections.

O presente estudo descreve aspectos tecnológicos, físico-químicos e biológicos de complexos formados entre nanoemulsões catiônicas e oligonucleotídeos (ON) antitopoisomerase II de P. falciparum. As formulações foram otimizadas através de um planejamento fatorial completo 23. Duas formulações compostas por triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo e pelo lipídeo catiônico oleilamina ou DOTAP foram selecionadas com base nas suas propriedades físico-químicas. ON fosfodiéster ou fosforotioato foram adsorvidos nas nanoemulsões catiônicas. As isotermas de adsorção indicam uma progressiva adsorção dos ON até que um platô seja atingido, descritos através do um modelo de adsorção de Langmuir. Foi detectada uma maior quantidade de ON adsorvida em nanoemulsões contendo DOTAP em comparação com as constituídas de oleilamina. Evidências suplementares da adsorção dos ON foram demonstradas através da inversão do potencial zeta. Análises topográficas e morfológicas, obtidas através de microscopia eletrônica de transmissão e de força atômica, sugerem a adsorção dos ON nas nanoemulsões. A organização estrutural em fase lamelar foi identificada através de difração de raios-X de energia dispersiva. A associação dos ON e hemólise aumentam com a relação de cargas dos complexos em eritrócitos sadios ou infectados por P. falciparum. Sondas fluorescentes (co-associadas nos complexos: fluoresceína e vermelho do Nilo) foram localizados em eritrócitos infectados nas etapas tardias do ciclo evolutivo dos parasitos por microscopia confocal. Em condições não hemolíticas, um efeito de inibição de cerca de 80% do crescimento de P. falciparum e um atraso no ciclo biológico do parasito foi observado in vitro. O conjunto dos resultados demonstra que o uso de complexos ON/nanoemulsões catiônicas podem representar uma estratégia promissora para o tratamento das infecções por P. falciparum.

La présente étude décrit des aspects technologiques, physico-chimiques et biologiques des complexes formés entre nanoémulsions cationiques et des oligonucléotides (ON) anti-topoisomérase II du Plasmodium falciparum. Les formulations ont été optimisées au travers d'un plan factoriel 23 complet. Deux formulations composées par des triglycérides à chaîne moyenne, de la lécithine de jaune d'oeuf et un lipide cationique oléylamine ou DOTAP ont été choisis en fonction de leur proprietés physicochimiques. ON phosphodiester ou phosphorothioate ont été adsorbés sur des nanoémulsions cationiques. Les isothermes d'adsorption indiquent une adsorption progressive des ON jusqu'à ce qu'un plateau soit atteint, décrit par un modèle d’adsorption de Langmuir. Il a été détecté une quantité plus élevé d’ON adsorbés sur des formulations contenant le DOTAP par rapport à celles constituées par oléylamine. Des évidences supplémentaires de l'adsorption des ON ont été démontrées par l'inversion du potentiel zeta. L’analyse topographique et morphologique des complexes, obtenue par microscopie électronique à transmission et à force atomique, suggère l’adsorption des ON sur les nanoémulsions. L'organisation strucutrale dans une phase lamellaire a été identifiée par diffraction des rayons X d'énergie dispersive. L’association des ON et l'hémolyse augmentent avec le rapport de charge de complexes sur les érythrocytes sains ou infectés par Plasmodium falciparum. Des sondes fluorescentes (coassociées dans les complexes: fluorescéine et rouge du Nil) ont été localisées dans les érytrocytes infectés dans les étapes tardives du cycle d’évolution des parasites par microscopie confocale. Dans des conditions non hémolytiques, un effet d'inhibition d'environ 80% de la croissance de P. falciparum et un retard du cycle du parasite ont été observés in vitro. Les résultats globaux montrent que les complexes ON/nanoemulsions cationiques peuvent represerter une stratégie prometteuse contre les infections par Plasmodium falciparum.