Avaliação da capacidade de genes sintéticos em conferir tolerância às geadas em plantas

Abstract

O gênero Eucalyptus pertence à família Myrtaceae e é composto em sua maioria por arbóreas florestais. Dentre outras aplicações, as espécies de Eucalyptus apresentam destaque na produção de papel e pastas de celulose. Entretanto, as baixas temperaturas registradas no inverno da região sul do Brasil e a ausência de tolerância ao frio e/ou ao congelamento na maioria das espécies de Eucalyptus limitam o crescimento e o desenvolvimento de plantas deste gênero. O desenvolvimento de linhagens híbridas como E. urophylla x E. globulus, combinando espécies de clima temperado e de clima tropical, tem resultado em sucesso no plantio de Eucalyptus em regiões subtropicais. Contudo, as baixas temperaturas e os recorrentes e irregulares eventos de geadas continuam a causar severos danos nas árvores e perdas na produtividade de madeira. Desta maneira, o objetivo proposto é testar a capacidade de genes sintéticos em conferir tolerância ao congelamento em plantas-modelo de Arabidopsis thaliana para que, futuramente, os mesmos possam ser empregados na obtenção de plantas transgênicas de Eucalyptus tolerantes às geadas. Baseados em trabalhos recentes publicados na literatura científica, foram selecionadas sequências promotoras responsivas ao frio e sequências codificadoras de proteínas potencialmente capazes de conferir tolerância ao congelamento. As sequências promotoras e codificadoras de proteínas, em conjunto com o terminador do gene codificador da enzima nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens, foram agrupadas em dois cassetes gênicos nomeados de PCOR15B-DaIRIP1-Tnos e PPpbec1- AnAFP-Tnos. As sequências nucleotídicas foram enviadas à empresa GenScript (EUA) onde foram sintetizadas e ligadas ao vetor plasmidial pUC57. Ambos os cassetes gênicos foram isolados do vetor pUC57 com o uso de enzimas de restrição. Posteriormente, os cassetes gênicos foram ligados ao plasmídeo pCAMBIA2300. As versões recombinantes de pCAMBIA2300 foram utilizadas para a transformação de plantas de A. thaliana via A. tumefaciens. Plantas transgênicas foram selecionadas por meio de resistência frente à canamicina e o estado de transgenia foi confirmado via Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Por fim, as linhagens obtidas foram avaliadas quanto à tolerância ao congelamento. Em paralelo, um método alternativo baseado em plasmídeos derivados de vírus foi avaliado para a obtenção de plantas de Eucalyptus expressando o gene repórter gfp. Futuramente, o método empregado poderá ser utilizado para a aquisição de plantas de Eucalyptus contendo genes de interesse.

The genus Eucalyptus belongs to the Myrtaceae family and most of its species are forest trees. Some Eucalyptus species have key importance for the industries of cellulose and paper besides other applications. The low temperatures in South Brazil during winter limit considerably the growth and exploitation of the genus in Southern states. The development of hybrid lineages like E. urophylla x E. globulus, combining a temperate and a tropical species, has proven great success in the forestry of subtropical regions. Nevertheless, erratic and repetitive frost events critically damage trees and determine great losses in timber production. In an attempt to improve frost tolerance in Eucalyptus, we are testing the capacity of synthetic genes to confer cold or freezing tolerance in plants. Arabidopsis thaliana is being employed as model plant to evaluable the potential of genes to render the required tolerance. Based on recent research works available in the scientific literature, we searched for potential protein coding sequences reported to confer cold or freezing tolerance, besides cold responsive promoters and terminator regions. Gene sequences were combined with the terminator region of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens in two different synthetic genes called PCOR15B-DaIRIP1-Tnos and PPpbec1-AnAFP-Tnos. Nucleotide sequences were synthesized and cloned into pUC57 by GenScript (USA). Both genes were digested from pUC57 by restriction enzymes and cloned into pCAMBIA2300 binary vector. A. thaliana plants were genetically transformed with the synthetic genes by A. tumefaciens. Transgenic lines were selected by antibiotic resistance and then confirmed by PCR. Later, freezing assays were carried out to check the ability of either gene to confer plant freezing tolerance. In parallel, an alternative method based on designed plasmids from viral genome sequences was performed to obtain Eucalyptus plants expressing the gfp gene. This method may be applied to obtain Eucalyptus plants with the interest traits.