Efeitos celulares e secreção de exossomos em células PANC-1 tratadas com gemcitabina

Abstract

O câncer de pâncreas é um tipo raro de tumor, mas se apresenta como o sétimo mais letal no mundo. Adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) caracteriza 90% dos casos. Possui uma evolução silenciosa e geralmente despercebida. Por isso, os pacientes buscam tratamento apenas em estágios avançados da doença, altamente infiltrada e com potencial metastático. Nesses casos a ressecção cirúrgica é impossível. A opção de tratamento é por via quimioterápica usando gemcitabina (GEM). Muitos casos de resistência a essa droga são registrados. A comunicação entre células tumorais e saudáveis parece ter um papel importante nesse fenômeno. A via de vesículas extracelulares é essencial para a realização dessa comunicação celular. Essas vesículas são estruturas de bicamada lipídica, classificadas por origem e tamanho. Exossomos (EXOs), as vesículas de 40 – 100 nm, formadas a partir de corpos multivesiculares, são caracterizadas por possuírem uma alta gama de moléculas e por sua alta capacidade de penetrância. Em ADP, são descritos como responsáveis por piores prognósticos e formação de nicho metastático. Entretanto seu papel na formação de quimioresistência e resposta inicial à droga permanece pouco explorado. Para investigar alterações em processos de comunicação celular através de EXOs como resposta à GEM nós caracterizamos os efeitos da exposição inicial da linhagem PANC-1 à droga e a liberação de EXOs durante esse tempo. Análises de citometria de fluxo utilizando anexina V, iodeto de propídio e laranja de acridina revelaram que GEM não induz metabolismo de morte, nem fluxo autofágico depois de 24 horas de tratamento com diferentes concentrações da droga. Contudo, GEM induziu alteração no tamanho das células. Utilizando Western blot para marcadores de EXO demonstramos diferenças na abundância das proteínas CD9 e CD54. Como a dose IC50 descrita de GEM, 10 µM demonstrou a mesma variação para ambos marcadores, a mesma foi utilizada nos demais testes. O sobrenadante de células tratadas e não-tratadas foi submetido a ultracentrifugação para isolamento de vesículas. Essas vesículas são EXOs como determinado por microscopia eletrônica de transmissão e espalhamento dinâmico de luz. Além disso, as células tratadas com 10 µM de GEM liberaram exosomos diferentes em tamanho, forma e organização, se comparados aos EXOs controle. Além disso, houve aumento na liberação de EXO pelas células tratadas. Como os EXOs mudam em resposta à GEM, é necessário investigar seu conteúdo e propriedades biológicas.

Pancreatic cancer is a rare cancer worldwide, however it is the seventh more lethal. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) comprises 90% of cases. It remains unnoticed due its silencing progression. Therefore, patients seek treatment in a very advanced state, high infiltrate and potentially metastatic. Surgical resection is impossible in most cases. Chemotherapeutic treatment is the remaining option, through gemcitabine (GEM). There are a lot of chemoresistant cases well described in literature. Cell communication between tumor and healthy cells appears to play an important role in this process. Extracellular vesicles pathway is essential in cell to cell communication. Those vesicles are double layer lipidic structures, classified by its origin and size. Exosomes (EXOs), vesicles ranging from 40 – 100 nm, and formed from multivesicular bodies, are reported as carrying a wide variety of molecules and with high penetrant capability. For PDAC, they are described as responsible for bad progressions and metastatic niche formation. However, their role during chemoresistant phenotype initiation, and initial response to drug contact remains little explored. To investigate possible changes in cell communication through EXOs as a response to GEM, we characterized PANC-1 initial response to drug and analyzed EXOs released during this time. Flow cytometry analyses using Annexin V, propidium iodide and acridine orange revealed that GEM do not induce death phenotype after 24 hours treatments with different concentrations, neither autophagic metabolism. However, GEM induces size increase in treated cells. Western blot analysis for EXO markers revealed changes in cellular abundance of CD9 and CD54. As IC50 reported 10 µM GEM concentration showed the same variation on protein abundance for these markers, it was used as treatment. Treated and untreated cells supernatants were ultracentrifugated for vesicles isolation. The vesicles obtained were confirmed as EXO by transmission electron microscopy and dynamic light scattering. Also 10 µM GEM treated cells exosomes, revealed to be smaller, different in shape and organization compared to vehicle treated exosomes. Moreover, treated cells EXOs increased concentration as response to GEM exposure. As EXOs change in response to GEM treatment, further investigation is needed to determine its cell changing capabilities.