Efeito do peptídeo beta-amilóide sobre a biossíntese de gangliosídeos e avaliação da atividade neuroprotetora do GM1

Abstract

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa cuja patogenia não é completamente elucidada. Atribui-se ao peptídeo beta-amilóide (A ), em sua forma oligomérica ou fibrilada, um importante papel neste processo. Uma vez que a produção e a fibrilação do peptídeo ocorrem ao nível de membrana neural, sua dinâmica e composição lipídica podem modular a cascata amilóide e/ou interferir na extensão do dano gerado pela mesma. Tendo isto em vista e considerando o potencial sinalizatório dos glicoesfingolipídios, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peptídeo betaamilóide (A 25-35), em sua forma fibrilada ou não-fibrilada, sobre a biossíntese dos gangliosídios em modelo de cultura organotípica de hipocampo. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar de 6-8 dias, dos quais o hipocampo foi dissecado, fatiado e submetido à cultura. No 28º dia de cultura foi adicionado A 25- 35 (25μM), em sua forma fibrilada ou não fibrilada; após 24h adicionou-se ao meio D- [1-14C]-galactose para avaliar a biossíntese dos gangliosídios; no 30º dia a morte celular foi analisada com iodeto de propídio. A partir das fatias, os gangliosídios radiomarcados foram extraídos, purificados, analisados por HPTLC, fluorografia e densitometria. Nossos resultados demonstraram uma alteração na biossíntese de gangliosídios induzida pelo peptídeo beta-amilóide A 25-35, um efeito que foi dependente de seu estado de fibrilação. Desta maneira, o A 25-35, em sua forma fibrilada, promoveu um aumento na biossíntese de GM3 e uma redução na biossíntese de GD1b, ao passo que o peptídeo não fibrilado levou a um aumento na síntese do gangliosídio GM1. Uma vez que o GM3 é considerado um gangliosídio apoptótico, quando expresso em neurônios adultos, um aumento em sua síntese pode estar relacionado aos eventos tóxicos desencadeados pelo peptídeo beta-amilóide fibrilado. O GM1, por sua vez, ainda não possui um papel suficientemente claro no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Uma série de efeitos neuroprotetores são atribuídos a este gangliosídio enquanto fortes evidências sugerem que o GM1 poderia acelerar o processo de fibrilação do beta-amilóide, e assim influenciar a progressão da doença. A fim de investigar o papel do GM1 no presente modelo, realizamos uma série de experimentos com a finalidade de avaliar uma possível ação neuroprotetora deste gangliosídio. Como resultado, um pré-tratamento das fatias hipocampais com GM1(10μM) foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pelo peptídeo beta-amilóide em sua forma fibrilada, como demonstram os resultados da captação de iodeto de propídio. Com o intuito de corroborar sua ação neuroprotetora, bem como investigar o mecanismo pelo qual esta neuroproteção seria mediada, analisamos o efeito de um tratamento com GM1 (1h, 6h, 12h ou 24h) sobre as alterações induzidas pelo peptídeo beta-amilóide no estado de fosforilação (ativação/inativação) da GSK3b. Nossos resultados demonstraram um importante efeito neuroprotetor do GM1 após 24 horas de tratamento, uma vez que nestas circunstâncias este gangliosídio foi capaz de reverter a ativação (defosforilação) da GSK3b, uma via de sinalização associada à morte celular programada. Como conclusão, nossos resultados dão suporte a participação dos gangliosídios em modelos de doença de Alzheimer, e sugerem uma ação neuroprotetora do gangliosídio GM1 frente à toxicidade induzida pelo beta-amilóide, o que, no futuro, pode ser explorado como uma alternativa terapêutica ao tratamento do Alzheimer.

Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose pathogenesis is still poorly understood. It is attributed to beta-amyloid peptide, in its fibrillar or nonfibrillar forms, an important role in the disease development and progression. Once the production and fibrillation of beta-amyloid peptide occurs on the neural membrane surface, the lipid dynamic and composition of these membranes could modulate amyloid cascade and/or interfere in the damage triggered by it. Taking this into account, and considering the potential signalling role of glycosphingolipids, the objective of this study was to investigate the effect of fibrillar and non-fibrillar beta-amyloid peptide (Ab25-35) upon ganglioside biosynthesis in a model of organotypic hippocampal culture. In order to do this, we used 6-8 days old Wistar rats, whose hippocampi were dissected, sliced and subjected to culture. On the 28th in vitro day, A 25-35 (25μM) was added to the culture medium, in its fibrillar or non-fibrillar forms. After 24h incubation, D-[1-C14]-galactose was added to the medium with the purpose of labeling ganglioside; on day 30th in vitro day cell death was analyzed by PI uptake. The radiolabeled gangliosides were extracted from the hippocampal slices, purified, and analyzed by HPTLC, fluorography and densitometry. Our results demonstrated an Ab25-35 induced alteration in ganglioside biosynthesis, an effect which seemed to be dependent on the peptide fibrillation state. Furthermore, the fibrillar Ab25-35 caused an increase in GM3 and a reduction in GD1b biosynthesis, whereas the non-fibrillar form of this peptide was able to enhance the synthesis of GM1 ganglioside. Once GM3 is an apoptotic ganglioside, when expressed in adult neurons, an increase in its synthesis could take part of the toxic events triggered by the fibrillar betaamyloid peptide. GM1, in turn, has a still poorly understood participation in Alzheimer development. A sort of neuroprotective effects are attributed to this ganglioside while several evidences suggest that GM1 could accelerate the endogenous fibril formation, and thence influence the disease progression. To further investigate the role of GM1 ganglioside in our model, we have performed some experiments in order to test a possible neuroprotective effect of this gangliosides. As a result, a pre-treatment of the hippocampal slices with 10μM GM1 was able to prevent the toxicity triggered by the fibrillar beta-amyloid peptide, when measured by PI uptake protocol. In order to corroborate its neuroprotective action, as well as to investigate a candidate mechanism by which GM1 could promote neuroprotection, we have analyzed the effect of GM1 treatment (1h, 6h, 12h and 24h) upon the amyloid-induced alterations in GSK3b phosphorylation/dephosphorylation state. Our results demonstrated an important effect of GM1 after 24h incubation, once it was able to reverse the amyloid-induced dephosphorilation (activation) of GSK3b, a signalling pathway involved in apoptosis triggering. Taken together, our results provides new and important support for the ganglioside participation in Alzheimer models, and suggests a protective role of GM1 upon the amyloid induced toxicity, which, in the future, could expand the therapeutic strategy available for Alzheimer disease treatment.