Estrutura versus função : aspectos estruturais e funcionais do Jaburetox e da urease de Proteus mirabilis

Abstract

Ureases são proteínas moonlighting, com mapeamento da estrutura-atividade ainda pouco compreendido. A urease de Proteus mirabilis (PMU) é um importante fator de virulência. PMU apresenta-se em solução como um trímero onde cada monômero apresenta três subunidades estruturais: PmUreα, PmUreβ e PmUreγ. Neste trabalho, identificamos que a PMU se comporta como agonista, promovendo agregação plaquetária e é tóxica a leveduras, provocando alterações morfológicas. Estas características foram já descritas para outras ureases e também identificadas para a PmUreβ. As subunidades γ e β da PMU são capazes de ativar o sistema imune do inseto Rhodnius prolixus e quando testadas em Dysdercus peruvianus, PmUreβ apresentou maior toxicidade que as subunidades recombinantes γ e α quando administrados por via oral a este inseto. A atividade de agonista da PMU acredita-se que seja devido à porção contida na PmUreβ identificada como uma duplicação gênica entre a PmUreβ e a urease de Canavalia ensiformis (JBU) correspondente à porção α na PMU. A atividade entomotóxica da JBU é devido à liberação do polipeptídeo jaburetox (Jbtx) após hidrólise da JBU por enzimas do tipo catepsina. A PMU e sua subunidade β apresentam um overlap de toxicidade com o Jbtx, devido à existência de uma duplicação gênica entre as sequências de nucleotídeos do Jbtx e da PmUreβ. Outro fator determinante para a toxicidade apresentada pela PmUreβ seria a perda de estrutura quando em solução, conforme descrito para o Jbtx, foi classificado como uma proteína intrinsicamente desordenada capaz de interagir com lipídios presentes na membrana celular alterando a permeabilidade da mesma, sugerindo a interação Jbtx-membrana como base para sua entomotoxicidade. Visando investigar esta interação, foram analisadas soluções contendo Jbtx em presença de modelos de membrana artificiais. Quando em presença de micelas compostas por SDS, Jbtx teve um aumento de estruturas secundária e terciária. Em presença de vesículas e bicelas, o polipeptídeo apresentou uma pequena alteração estrutural nas porções N e C-terminal. Nossos resultados sugerem que o Jbtx é capaz de ancorar-se à membrana celular de insetos, devido uma interação com os lipídios presentes na mesma, de modo a facilitar seu contato com um alvo específico presente na membrana plasmática.

Ureases are moonlighting proteins, with poorly structure-activity mapping properties characterized. Urease from Proteus mirabilis (PMU) is an important virulence factor for this bacteria. PMU is a trimeric protein in which each monomer is composed by three structural subunits: PmUreα, PmUreβ and PmUreγ. In this work, we identified that PMU acts as an agonist, promoting platelet aggregation and was shown to be toxic against yeasts causing morphological alterations, the same characteristics observed for PmUreβ and already described for other ureases. PmUreγ and PmUreβ subunits are able to activate the immune system of the insect Rhodnius prolixus. In addition, when tested against Dysdercus peruvianus, PmUreβ showed higher toxicity to this insect than the recombinant subunits α or γ if administered orally. The agonist activity of PMU is due to a portion of intragenic duplication at PmUreβ, this duplication was found between ureB and Canavalia ensiformis (JBU) gene corresponding to a subunit from PMU. Entomotoxic activity of JBU is mainly due to a polypeptide release, this polypeptide is called jaburetox (Jbtx), after urease hydrolysis by cathepsin-like enzymes. Both PmUreβ and Jbtx present regions of intragenic duplication, which seem to be an explanation for the toxicity of PMU and Jbtx overlap. A second issue is that PmUreβ looses its structure when in solution, the same characteristic described for Jbtx that is an intrinsically disordered polypeptide able to interact with lipids present on cellular membranes. That interaction alters its permeability hinting to a role of Jbtx-membrane interaction as the basis for its toxicity. Intending to investigate the interaction between Jbtx and cellular membranes we performed experiments of Jbtx in presence of artificial membranes (micelles, large unilamellar vesicles - LUVs, and bicelles). The polypeptide when in presence of SDS micelles had an increase of its secondary and tertiary structures. When Jbtx interacted with LUVs, and bicelles as well, the polypeptide presented a slight change of structure at its terminal regions. Our results suggest that Jbtx could anchor to the cellular membrane by an interaction with lipids in order to facilitate its interaction with a membrane-bound target present at the plasma membrane.