Estudo piloto clínico experimental de coleta e armazenamento de material de carcinoma pulmonar para utilização em pesquisa biomédica

Abstract

A conservação do patrimônio genético trouxe a necessidade de novas formas de diagnóstico e tratamento do câncer de pulmão, pelo qual faz-se necessário a coleta e conservação de tecidos frescos, com uma maior qualidade, e que permitam o estudo dos fenômenos moleculares desta patologia. Objetivo: Estabelecer um mecanismo estrutural e organizacional para a coleta, preservação, armazenamento, viabilidade e análise molecular de amostras de tecido tumoral pulmonar, tecido pulmonar adjacente saudável e sangue: provenientes de pacientes com diagnóstico de câncer de pulmão. Metodologia: O projeto foi realizado como um ensaio piloto clínico experimental longitudinal, prospectivo e não randomizado no qual o mesmo indivíduo é estudado em seu perfil genético e molecular através de diferentes amostras coletadas. A seleção da amostra foi feita por conveniência, não probabilística, não aleatória e intencional, em três protocolos com diferentes momentos de coleta, conservação e armazenamento, relacionados com a data da cirurgia e com diferentes criopreservantes e meios de cultura: protocolo 1: 200μl solução salina NaCl 0,9 % / 20μl soro fetal bovino e 200μl RNALater, protocolo 2:com 300μl PBS e 200μl RNALater, e protocolo 3: 4ml de RPMI 1640 e 200μl RNALater. Foram coletados a fresco 20ml de sangue periférico, duas amostras de tecido tumoral de pulmão, duas amostras de tecido adjacente de pulmão saudável, e linfonodo mediastinal dos pacientes estudados e criopreservadas a -80oC. Resultados: Os tumores coletados no estudo foram adenocarcinoma (69%), carcinoma indiferenciado (19%) e carcinoma epidermoide (12%), de um total de 16 pacientes. As amostras de sangue periférico foram conservadas como soro e plasma a -80oC, e realizada imunofenotipagem com citometria de fluxo em sangue periférico a fresco. Com as amostras de tumor, criopreservadas por onze meses em solução salina NaCl/SFB e RNALater, e por três meses em RPMI 1640 obtivemos linhagem celular com a dissociação celular do tecido tumoral demonstrando a viabilidade das amostras. A funcionalidade das amostras de tumor conservadas a fresco em RPMI 1640 demonstrou a presença de marcadores imunofenotípicos relacionados com a presença /ausência dos linfócitos T e B na citometria de fluxo. Não há crescimento da cultura celular em RPMI nas amostras de tumor transportadas no PBS dos 7 pacientes do protocolo 2. Conclusões: Um sistema com uma estrutura organizada foi desenvolvido e aperfeiçoado para a coleta, preservação e armazenamento de amostras de sangue, tecido pulmonar saudável, tecido tumoral pulmonar e linfonodal em pacientes com carcinoma pulmonar de células não pequenas. Demonstramos a viabilidade e funcionalidade das amostras de sangue periférico e tumor de pulmão com a presença dos marcadores imunofenotípicos como CD3, CD4, CD8, CD19, CD26, CD38, CD39 e CD69 ao realizar Imunotipagem com citometria de fluxo, relevantes na predição e prognóstico do câncer de pulmão.

The conservation of genetic patrimony has brought the need for new ways of diagnosing and treating lung cancer, so it is necessary to resume the collection and conservation of fresh tissues, of higher quality, which allow the study of molecular phenomena of this pathology. Objective- To establish a structural and organizational mechanism for the collection, preservation, storage, viability and molecular analysis of samples of lung tumor tissue, healthy adjacent lung tissue and blood: from patients diagnosed with lung cancer. Methodology- The project was carried out as a longitudinal, prospective, non-randomized experimental pilot trial in which the same individual is studied in his genetic and molecular profile in different samples collected. Sample selection was done for convenience, non-probabilistic, non-random and intentional; in three protocols with different collection, conservation and storage times, related to the date of surgery; with different cryopreservants and culture mediums, such as: protocol 1: 200μl NaCl 0.9 % saline solution / 20μl bovine fetal serum and 200μl RNALater, protocol 2: with 300μl PBS and 200μl RNALater, and protocol 3: 4ml RPMI 1640 and 200μl RNALater . Were collected in fresh 20ml of peripheral blood, two samples of tumor tissue from lung, two samples of adjacent healthy lung tissue, and one whole lymph node by patients studied; cryopreserved at -80 oC Results- The tumors collected in the study were ׃adenocarcinoma (69%), undifferentiated carcinoma (19%), and squamous cell carcinoma (12%) from a total of 16 patients in the study. Peripheral blood samples were conserved as serum and plasma at -80 oC, and we performed immunophenotyping with cytometry in fresh peripheral blood. With the tumor samples, cryopreserved for eleven months in Nacl/SFB and RNALater saline solution, and for three months in RPMI 1640 we obtained cellular lineage with cell dissociation of the tumor tissue demonstrating the viability of the samples. The functionality of the freshly preserved tumor samples in RPMI 1640 demonstrated the presence of immunophenotypic markers related to the presence/absence of T and B lymphocytes through immunophenotyping with flow cytometry. There is no growth of cellular culture in the tumor samples transported in the PBS of the 7 patients of protocol 2. Conclusions- An organized structure mechanism was established for the collection, preservation and storage of blood samples, healthy lung tissue, tumor lung tissue and lymph node in patients with non-small cell carcinoma. We demonstrated the viability and functionality of peripheral blood and lung tumor samples with the presence of immunophenotypic markers such as CD3, CD4, CD8, CD19, CD26, CD38, CD39 and CD69 by performing Immunotyping with flow cytometry, relevant in the prediction and prognoses of lung cancer.