O papel da proteína BRCA-1 sobre a resposta de macrófagos ativados pelas vias clássica, alternativa e quando expostos a meio condicionado de gliomas

Abstract

Macrófagos são células apresentadoras de antígenos que respondem a sinais inflamatórios possuindo amplo perfil fenotípico de acordo com cenário fisiológico. A atividade de macrófagos é peça importante para a homeostase tecidual, atuando na defesa do hospedeiro no combate a infecções, reparo tecidual e também na regulação de células imunes adjacentes. Além disso, macrófagos se mostram como peça chave no desenvolvimento de tumores, inclusive os cerebrais. A proteína BRCA-1 (BReast CAncer-1) é envolvida no reparo de DNA dependente de recombinação homóloga, reconhecendo e evitando a permanência de danos de fita dupla na molécula de DNA. Mutações ou mudanças na expressão de BRCA-1 são relacionadas com o surgimento (hereditário ou não) de câncer de mama, ovário e próstata. BRCA-1 apresenta propriedades em contextos inflamatórios, porém pouco explorada na biologia de macrófagos. O objetivo desta tese foi analisar a interferência da baixa expressão de BRCA-1 induzida por silenciamento em parâmetros inflamatórios da resposta de macrófagos RAW 264.7 diferenciados a fenótipos clássico, alternativo bem como quando expostos a meio condicionado de culturas de glioblastoma (CMC6). Os macrófagos silenciados apresentaram maior fragmentação de DNA através do ensaio de cometa; houve parada do ciclo celular na transição G1/S causada pelos tratamentos com LPS e meio condicionado de linhagem C6 de glioma (CMC6) e as células silenciadas mostraram também menor sobrevivência após as exposições. O silenciamento de BRCA-1 atenuou a expressão de TNF-α e IL-6 aumentadas por LPS e CMC6 além de ter aumentado a produção de marcadores anti-inflamatórios como TGF-β e IL-10. Os tratamentos com LPS e CMC6 causaram aumento no número de células autofágicas e o silenciamento de BRCA-1 potencializou a autofagia nestes tratamentos, inclusive nos macrófagos expostos a IL-4. A atividade do fator de transcrição NF-kB foi comprometida nas células silenciadas uma vez que os tratamentos com LPS e CMC6 estimularam sua atividade transicional. Os experimentos de “docking” molecular mostram que a conservação do domínio BRCT de BRCA-1 é importante para a interação física entre a proteína e a subunidade p65 de NF-kB, e que mutações em BRCA-1 relacionadas a neoplasias BRCA-1 dependentes impedem a formação do complexo BRCA-1-p65, sendo um forte indicativo da perda de capacidade inflamatória para macrófagos diferenciados. Análises de imunocitoquímica mostraram que a expressão de BRCA-1 diminuiu a presença da subunidade p65 de NF-κB no núcleo das células estimuladas por LPS e CMC6. Nossos resultados revelam que a expressão constitutiva de BRCA-1 exerce papel central na ativação de macrófagos por alterar as vias responsivas ao fator de transcrição NF-κB, além de abrirem perspectivas para futuras investigações sobre o papel de BRCA-1 que abordem não somente o reparo de DNA e sobrevivência celular, mas também sobre vias de resposta inflamatória destes fagócitos frente a processos inflamatórios e neoplasias gliais.

Macrophages are antigen present cells which respond to inflammatory signals having a wide phenotypic profile according to physiological status. Macrophage activity is an important part of tissue homeostasis, acting in the host defense against infection, tissue repair and also in the regulation of adaptative immune cells. In addition, macrophages play a key role in the development of tumors, including the brain. The BRCA-1 protein (BReast CAncer-1) is involved in homologous recombination-dependent DNA repair, recognizing and avoiding the permanence of double-stranded damage to the DNA molecule. Mutations or changes in BRCA-1 expression are related to the onset (hereditary or not) of breast, ovarian and prostate cancer. BRCA-1 has properties in inflammatory contexts, but little explored in macrophage biology. The aim of this study was to analyze the interference of knockdown expression of BRCA-1 on inflammatory mediators of RAW 264.7 macrophage differentiated to classical, alternative phenotypes as well as when exposed to conditioned medium of glioblastoma culture (CMC6). The silenced cells showed increased DNA fragmentation demonstrated by the comet assay; there was a cell cycle arrest in the G1 / S transition caused by LPS and CMC6 treatments and the silenced cells showed decreased survival after exposure. BRCA-1 knockdown attenuated LPS and CMC6-enhanced expression of TNF-α and IL-6 and pronounced the production of anti-inflammatory markers such as TGF-β and IL-10. LPS and condioned medium of C6 glioma cell line (CMC6) treatments caused an increase in the number of autophagic cells and BRCA-1 low expression pronounced acridine orange incorporation, suggesting an increase of autophagy in these treatments, also observed in macrophages exposed to IL-4when BRCA-1 is compromised by siRNA. NF-kB activity was abrogated in the silenced cells since LPS and CMC6 treatments stimulated it transcriptional activity. Molecular docking experiments show that the conservation of the BRCA-1 BRCT domain is important for the physical interaction between the protein and the NF-kB p65 subunit, and that BRCA-1 mutations related to tumors incidence refrain formation of the BRCA-1-p65 complex, suggesting relevance to this interaction related to the loss of inflammatory capacity for differentiated macrophages. Immunocytochemistry assays showed that BRCA-1 expression decreased the presence of the NF-κB p65 subunit in the nucleus of cells stimulated by LPS and CMC6, indicating a decrease of nuclear activity of p65. Our results reveals that constitutive expression of BRCA-1 in macrophages plays a central role in its activation by changing NF-κB transcription factor-responsive pathways, and open perspectives for future investigations into the role of BRCA-1 that address not only the DNA repair and cell survival but also inflammatory response pathways of these phagocytes in inflammatory outcome as well as in situations of glial tumorogenesis.