Caracterização fenotípica e genotípica de cepas de salmonella pertencentes a diferentes sorovares isoladas de matrizes e de frangos de corte no campo, de carcaças de frango e de alimentos envolvidos em surtos de salmonelose

Abstract

A expansão da avicultura resultou em um aumento no número de aves alojadas e na concentração de unidades de produção, assim facilitando a disseminação de doenças, especialmente aquelas transmitidas pelo consumo dos produtos avícolas. Salmonella spp. continua sendo um dos principais agentes causadores de doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo, inclusive no Brasil. O objetivo deste trabalho foi a caracterização fenotípica e molecular de cepas de Salmonella spp. pertencentes a diferentes sorovares e isoladas de matrizes e de frangos de corte no campo, de carcaças de frango e de alimentos envolvidos em surtos de salmonelose. Foi realizada a avaliação da capacidade de produção de biofilme em placas de poliestireno submetidas a temperaturas de incubação de 37ºC, 28ºC, 12ºC e 3ºC, a fim de simular as variações de temperatura que os produtos de origem animal sofrem do campo até a residência do consumidor. Também foi realizada a avaliação da resistência antimicrobiana através da técnica de disco-difusão em ágar frente a dez antimicrobianos. Cepas multirresistentes foram caracterizadas genotipicamente para genes de resistência antimicrobiana. Para a caracterização molecular foi realizada a pesquisa de 27 genes associados à virulência através de PCR. Também foi feita a determinação do fagotipo PT4 e a ribotipificação de cepas de S. Enteritidis através de PCR. Entre as cepas analisadas, 71,6% produziram biofilme, mas a maioria de forma fraca. As cepas apresentaram comportamentos distintos nas diferentes temperaturas de incubação, demonstrando que há forte influência da temperatura na produção de biofilme. A produção destas estruturas não está associada à origem de isolamento da cepa, mas está parcialmente associada aos sorovares. As maiores resistências antimicrobianas, independentemente do sorovar e da origem de isolamento da cepa, foram para sulfafurazol, ciprofloxacina, enrofloxacina e tetraciclina. Observouse que a resistência a alguns antimicrobianos está associada ao sorovar e à fonte de isolamento da cepa. Aproximadamente 14% das cepas foram classificadas como multirresistentes, sendo a maioria de origem avícola. Apenas dois genes de resistência (blaPSE e floR) não foram detectados. A maioria dos genes de virulência (invA, hilA, lpfA, lpfC, agfA, avrA, sivH, orgA, prgH, spaN, tolC, sipB, sitC, pagC, msgA, spiA, sopB, sifA, sseL, stn) apresentou frequência superior a 90%. Oito genes (sefA, lpfA, lpfC, spvB, spvC, pefA, sopE e iroN) estão associados com o sorovar, oito (spvB, spiA, pagC, sipB, prgH, spaN, sitC e lpfC) estão associados com as fontes avícolas e um gene (iroN) está associado às cepas de origem humana. Não se observou relação entre produção de biofilme e resistência antimicrobiana e entre os genes de virulência e a produção de biofilme. Entre as cepas analisadas, 94,7% foram classificadas como S. Enteritidis PT4. A análise das cepas circulantes entre humanos e animais através da ribotipificação por PCR indica que um mesmo clone de S. Enteritidis é responsável por surtos de salmonelose e está disseminado nos diferentes elos da produção avícola. O sequenciamento de DNA confirmou a similaridade genética observada na ribotipificação. Estes resultados ressaltam a importância do controle de Salmonella spp. e do monitoramento em toda produção animal e em saúde pública.

The poultry industry has been characterized by an increase in the number of housed animals in recent years, concentrating the production and facilitating the spread of many diseases. Among all illness transmitted by food, salmonellosis is of particular importance. The aim of this work was to characterize, by phenotypic and molecular typing methods, strains of Salmonella spp. belonging to different serovars and isolated from breeders and broilers in the field, poultry carcasses and foods involved in salmonellosis outbreaks. Biofilm production in polystyrene microtiter-plates was evaluated at 37ºC, 28ºC, 12ºC and 3ºC, in order to simulate the temperature changes that animal products suffer from the field to the consumer's residence. Antimicrobial susceptibility testing was performed by the disk diffusion method to ten antimicrobial agents. The molecular characterization of multidrug-resistant strains was performed by PCR to resistance genes. Individual and multiplex PCR were conducted for the detection of 27 virulence-associated genes and for the detection of S. Enteritidis PT4 strains. PCR-ribotyping was performed to determine the clonal relationship among S. Enteritidis strains. 71.6% of total strains were biofilm producers, but the majority was weak producer. The strains had different behaviors in different incubation temperatures, demonstrating that there is a strong influence of temperature on biofilm production. The production of these structures is not associated with source of isolation, but is partially associated with serovars. The greatest antimicrobial resistances, regardless of the serovar and the isolation source, were to sulfafurazol, ciprofloxacin, enrofloxacin and tetracycline. It was observed that resistance to some antibiotics is associated with the serovar and with the isolation source. Approximately 14% of the strains were multidrug-resistant, most of them from poultry origin. Only two resistance genes (blaPSE and floR) were not detected. 20 genes (invA, hilA, lpfA, lpfC, agfA, avrA, sivH, orgA, prgH, spaN, tolC, sipB, sitC, pagC, msgA, spiA, sopB, sifA, sseL, stn) had a frequency higher than 90%. Eight (sefA, lpfA, lpfC, spvB, spvC, pefA, sopE and iroN) are associated with serovar, eight (spvB, spiA, pagC, sipB, prgH, spaN, sitC and lpfC) with poultry sources and only one gene (iroN) is associated with strains from outbreaks. There is no relation between biofilm production and antimicrobial resistance, neither between virulence genes and biofilm production. 94.7% of the evaluated strains were classified as S. Enteritidis PT4. The ribotyping analysis of circulating strains among humans and animals indicates that one clone of S. Enteritidis is responsible for salmonellosis outbreaks and it is circulating in the poultry production chain. DNA sequencing confirmed the genetic similarity observed in PCR-ribotyping. These results emphasize the importance of monitoring and control of Salmonella in all animal production chains and in the public health system.