Avaliação de técnicas de isolamento e comparação de células-tronco mesenquimais humanas de membrana amniótica, membrana coriônica, cordão umbilical e decídua da placenta

Abstract

Base teórica: Células-tronco mesenquimais (CTMs) são células multipotentes, com capacidade de autorrenovação e diferenciação. Devido às suas características, têm sido estudadas para utilização na terapia celular de diferentes patologias. Podem ser isoladas da medula óssea, tecido adiposo, tecidos neonatais, polpa dentária, entre outros. A utilização de CTMs isoladas de tecidos neonatais apresenta vantagens sobre as fontes de tecidos adultos, como quantidade e facilidade de obtenção, sem envolvimentos éticos associados, ausência de traumas para o doador, células com menor possibilidade de incorporação de mutações, melhor diferenciação, menor imunogenicidade e melhor capacidade de homing. As características biológicas das CTMs, bem como o seu potencial terapêutico, podem variar dependendo da fonte e protocolo de isolamento utilizados. Objetivo: Comparar protocolos para isolamento de CTMs de quatro fontes humanas de um mesmo indivíduo: decídua da placenta (D-CTMs), membrana amniótica (A-CTMs), membrana coriônica (C-CTMs) e segmento do cordão umbilical (CU-CTMs), a fim de definir o melhor protocolo de isolamento para cada fonte tecidual. Além disso, comparar as CTMs isoladas destas fontes teciduais em relação à imunofenotipagem, capacidade de diferenciação, tamanho em suspensão e cultura, índice de polaridade e potencial de crescimento. Métodos: Foram isoladas D-CTMs, A-CTMs, C-CTMs e CU-CTMs de doadoras saudáveis utilizando quatro protocolos enzimáticos de isolamento. Os tecidos foram submetidos a quatro protocolos de isolamento. As CTMs isoladas foram submetidas a ensaio de diferenciação in vitro, imunofenotipagem por citometria de fluxo, ensaio de dobro populacional, comparação do tamanho em suspensão por citometria de fluxo, análise do comprimento e largura em cultura e cálculo do índice de polaridade. Todos estes parâmetros foram comparados entre as CTMs isoladas e foi realizada análise estatística, considerando significativo p<0,05. Resultados: Foi possível isolar e caracterizar as CTMs de todas as fontes estudadas. A- CTMs e CU-CTMs foram isoladas de todas as amostras utilizando protocolos com tripsina e colagenase; C-CTMs foram obtidas de todas as amostras com dois protocolos, sendo um utilizando colagenase isoladamente e outro associando colagenase e tripsina; D-CTMs foram isoladas em todas as amostras exclusivamente com o protocolo à base de colagenase. C-CTMs em suspensão apresentaram o tamanho menor, enquanto CU-CTMs apresentaram o maior comprimento e a menor largura quando em cultura. A-CTMs mostraram menor índice de polaridade e CU-CTMs foram as células mais alongadas, com o índice de polaridade mais elevado. C-CTMs, D-CTMs e CU-CTMs foram semelhantes em capacidade de crescimento até P8; C-CTMs apresentaram maior longevidade em cultura, enquanto A-CTMs apresentaram proliferação insignificante. Conclusão: O protocolo utilizando colagenase foi considerado o ideal para obtenção de D-CTMs e C-CTMs, enquanto CU-CTMs puderam ser isoladas usando protocolos que utilizam associação de colagenase e tripsina. Não foi possível determinar um protocolo adequado para isolamento de CTMs de membrana amniótica. Tanto tecidos fetais, quanto o tecido materno podem ser utilizados como fonte de CTMs. Porém, considerando as vantagens de células imaturas, CTMs isoladas de cordão umbilical e membrana coriônica demonstraram ser uma opção mais apropriada para avançar em estudos visando a utilização em terapia celular.

Background: Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells with differentiation and self renewal ability. From this, many studies involve the isolation, cultivation and application of MSCs for therapeutic use in a diversity of diseases. Studies using MSCs employed bone marrow and adipose tissue as principal sources. However, fetal adnexa appears as a good alternative for MSCs isolation, since it is usually discarded without use, obtained easily in large quantities, with non-invasive collection, without ethical implications associated, without trauma to the donor and presents lower adverse effects in clinical trials. Biological properties and therapeutic potential of MSCs depends on source and the isolation protocol used. Objective: The objective of this study was to compare the effectiveness of four enzyme-based protocols for MSC isolation from four human fetal adnexa (amniotic membrane – A-MSCs, chorionic membrane – C-MSCs, umbilical cord - UC-MSCs and placental decidua – D-MSCs) and to define the optimal protocol for isolation from each tissue. Moreover, to compare biological characteristics of MSCs isolated from these sources in order to verify immunophenotipe, differentiation ability, size, polarity index and growth kinetics. Methods: Tissues were collected from healthy mothers and four protocols were applied for isolation of MSCs. Immunophenotipe, differentiation ability, cell size, cell complexity, polarity index and grow kinetics of MSCs isolated from the four sources were analyzed. MSCs were compared considering all parameters. Differences were considered significant when p<0.05. Results: MSCs were successfully isolated from all four sources. The surface marker profile and differentiation ability were consistent with human MSCs. A-MSCs and UC-MSCs could be isolated from all samples using trypsin/collagenase-based protocols; C-MSCs could be isolated from all samples with collagenase- and trypsin/collagenase-based protocols; and D-MSCs were isolated from all samples exclusively with a collagenase-based protocol. MSCs in suspension were the smaller cells, while UC-MSCs presented the higher length and lower width. A-MSCs showed a lower polarity index and UC-MSCs were the more elongated cells, with the higher polarity index. C-MSCs, D-MSCs and UC-MSCs were similar in growth capacity until P8; C-MSCs presented better lifespan and insignificant proliferation was observed in A-MSCs. Conclusion: The collagenase-only protocol was best for C-MSCs and D-MSCs, while a combination of trypsin and collagenase was considered best for UC-MSCs. None of the tested protocols was adequate for isolation of A-MSCs; all yielded heterogeneous cultures with short lifespans and limited cell growth. Both fetal and maternal tissues serves as source of multipotent stem cells. However, chorionic membrane and umbilical cord were considered good options for future use in cell therapy because of its advantages of immature cells.