Biossíntese de vitamina B12 por Lactobacillus plantarum BL011 e Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii em efluente ácido do isolamento de proteína de soja

Abstract

A deficiência em vitamina B12 ainda existe e uma das principais causas é a baixa ingestão de produtos de origem animal, afetando principalmente vegetarianos, veganos e a população de países subdesenvolvidos. Alternativas biotecnológicas vem sendo estudadas na literatura visando atender a demanda nutricional da população através da produção de vitamina B12 em meios de cultivo alternativos como os resíduos agroindustriais e bio-enriquecimento de alimentos. Objetivou-se com este estudo investigar a biossíntese de vitamina B12 utilizando o efluente agroindustrial de soja (LAPRS) como meio de cultivo alternativo de baixo custo e livre de produtos de origem animal. O LAPRS foi doado por uma empresa local e os microrganismos utilizados no estudo foram o Lactobacillus plantarum BL011 e a Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ATCC 13673. O LAPRS foi concentrado até 25% do volume inicial e caracterizado quimicamente. A quantificação da vitamina B12 foi realizada em sistema HPLC-DAD e um processo de validação foi conduzido para garantir a confiabilidade do resultados. Afim de selecionar um método adequado para extração da vitamina B12, foram testados 3 métodos comumente empregados no rompimento celular, sendo eles: calor úmido, ultrassom e moinho de bolas (pérolas de vidro). Para maximizar a biossíntese do micronutriente, a suplementação do LAPRS com elementos chave foi testada através de planejamento experimental Plackett & Burman contendo 8 variáveis analisadas em 2 níveis e 3 repetições no ponto central. A partir dos resultados obtidos nesses experimentos foi conduzido um novo planejamento experimental do tipo composto central 22 para otimzar a concetração das variáveis que apresentaram efeito positivo sobre a biossíntese. (continua). Em relação aos resultados, a análise da composição química do LAPRS concentrado revelou alta concentração de carboidratos totais (51,45 g.L-1), proteínas (12 g.L-1) e também micronutrientes como potássio (5478 mg.L-1), fósforo (527 mg.L-1) e magnésio (370 mg.L-1). Entretanto, o mineral cobalto componente central da cobalamina, não foi detectado e portanto foi uma das variáveis testadas no planejamento Plackett & Burman. O método selecionado para quantificação da vitamina B12 apresentou boa linearidade (R2 > 0,99) nos intervalos de concentração estudados (0,25 até 5 mg.L-1). Além disso, apresentou baixos limites de detecção (0,07 mg.L-1) e quantificação (0,21 mg.L-1). Em relação a extração de vitamina B12, o método de calor úmido revelou alta eficácia frente aos demais métodos testados e foi aplicado nos experimentos posteriores. Os resultados da biossíntese de vitamina B12 por L. plantarum demonstraram que a linhagem foi incapaz de produzir o micronutriente na concentração detectável pelo sistema HPLC-DAD, sendo assim, somente a linhagem propiônica foi utilizada no estudo de suplementação. A suplementação do LAPRS com cloreto de cobalto, 5,6-dimetilbenzimidazol (DMBI) e cloreto de cisteína exerceu efeito positivo sobre a biossíntese de vitamina B12 por P. freudenreichii subsp. shermanii. O acúmulo máximo do micronutriente nas condições ótimas foi igual a 0,59 mg.g-1 células. Este é o primeiro relato sobre a biossíntese de vitamina B12 em LAPRS e resultados promissores foram obtidos Ainda assim, alguns parâmetros devem ser otimizados para extrair o máximo rendimento deste bioprocesso.

Vitamin B12 deficiency still exists and one of the main causes is the low intake of animal products, affecting vegetarians, vegans and the population of underdeveloped countries. Biotechnological alternatives have been studied aiming to meet the nutritional demand of the population through the production of vitamin B12 in alternative culture media such as agroindustrial residues and bio-enrichment of food. The objective of this study was to investigate the biosynthesis of vitamin B12 using the soybean agroindustrial effluent (LAPRS) as an alternative, low-cost and animal free culture media. The LAPRS was donated by a local company and the microorganisms used in the study were Lactobacillus plantarum BL011 and Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ATCC 13673. LAPRS was concentrated to 25% of the initial volume and chemically characterized. Quantification of vitamin B12 was performed in the HPLC-DAD system and a validation process was conducted to ensure the reliability of the results. In order to select a suitable method for extraction of vitamin B12, 3 methods commonly used in cell disruption were tested, among them: humid heat, ultrasound and ball mill (glass beads). In order to maximize micronutrient biosynthesis, LAPRS supplementation with key elements was performed using the Plackett & Burman experimental plan containing 8 variables analyzed at 2 levels and 3 replicates at the central point. From the results obtained in these experiments, a new experimental design of the central composite 22 was conducted to optimize the concentration of the variables that had a positive effect on biosynthesis. In relation to the results, the analysis of the chemical composition of the concentrated LAPRS revealed a high concentration of total carbohydrates (51.45 g.L-1), proteins (12 g.L-1) and also micronutrients such as potassium (5478 mg.L-1) phosphorus (527 mg.L-1) and magnesium (370 mg.L-1). However, the mineral cobalt core component of cobalamin, was not detected and therefore was one of the variables tested in the Plackett & Burman design. The method selected for quantification of vitamin B12 showed good linearity (R2> 0.99) in the concentration ranges studied (0.25 to 5 mg.L-1). In addition, it presented low detection limits (0.07 mg.L-1) and quantification (0.21 mg.L-1). In relation to the extraction of vitamin B12, the wet heat method showed high efficacy compared to the other methods tested and was applied in the later experiments. The results of vitamin B12 biosynthesis by L. plantarum demonstrated that the lineage was unable to produce the micronutrient at the concentration detectable by the HPLC-DAD system, so that only the propionic strain was used in the supplementation study. Supplementation of LAPRS with cobalt chloride, 5,6-dimethylbenzimidazole (DMBI) and cysteine chloride had a positive effect on vitamin B12 biosynthesis by P. freudenreichii subsp. shermanii. The maximum micronutrient accumulation under optimum conditions was 0.59 mg.g-1 cells. This is the first report on vitamin B12 biosynthesis in LAPRS and promising results were obtained. Nevertheless, some parameters must be optimized to extract the maximum yield of this bioprocess.