Identificação e análise de conservação de RNAs circulares presentes no gênero Oryza

Abstract

Os RNAs circulares (circRNAs) constituem uma interessante classe de moléculas dentro do diverso mundo dos RNAs. Uma ligação fosfodiéster unindo uma extremidade 3’ doadora de splicing à uma extremidade 5’ aceptora de splicing confere à molécula circular alta estabilidade, devido à ausência de extremidades livres passíveis de degradação por exonucleases. Esses transcritos foram inicialmente descobertos em viróides de plantas e posteriormente em eucariotos, mas receberam pouca atenção até o advento de tecnologias de sequenciamento de nova geração, que permitiram identificá-los em diversos grupos de organismos nos domínios da vida. Estudos têm mostrado que tais moléculas participam da regulação gênica nos níveis transcricional e pós-transcricional, estão associados a processos patológicos em mamíferos e são responsivos a diferentes tipos de estresses em plantas. Neste trabalho, foi realizada a identificação in silico de circRNAs em Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare, que resultou na detecção de mais de 89 mil eventos preditos de backsplicing. Desse total, foram selecionados para validação doze circRNAs que satisfizeram critérios específicos, como terem sido detectados por pelo menos três métodos de bioinformática e possuírem sítios de ligação para microRNAs. Entre esses, nove sequências foram confirmadas em amostras de folhas em diferentes estágios, através de RT-PCR com o uso de primers divergentes e dessas, sete foram confirmadas por ressequenciamento. A maioria dos circRNAs testados, exibiram múltiplos produtos de PCR, indicando a ocorrência de circularização alternativa do transcrito primário, processo já observado em outros trabalhos. A conservação dos transcritos circulares confirmados por ressequenciamento foi em seguida testada em diferentes tecidos de outras seis espécies do gênero Oryza. As espécies O. sativa f. spontanea, O. rufipogon e O. punctata apresentaram amplificação de pelo menos um circRNA nas amostras de folha testadas. Nas amostras de raiz, as espécies O. sativa f. spontanea, O. rufipogon, O. punctata e O. australiensis também apresentaram amplificação para pelo menos um dos circRNAs testados. Os genes parentais dos circRNAs identificados inicialmente em O. sativa possuem homólogos nas demais espécies avaliadas, porém, alguns circRNAs exibiram produtos de PCR com tamanhos diferentes dos esperados para O. sativa, sendo que devem ser ressequenciados para confirmação de que são oriundos dos circRNAs testados. A possibilidade de encontrar circRNAs conservados entre diferentes espécies do gênero Oryza oferece um novo nível molecular para estudo de características genéticas potencialmente úteis do ponto de vista agronômico, além de contribuir para a compreensão dos processos evolutivos dessa classe de RNA.

Circular RNAs (circRNAs) constitute an interesting class of molecules within the diverse world of RNAs. A phosphodiester linkage attaching a splicing donor 3' end to a 5' splicing acceptor end gives the circular molecule high stability, due to the absence of free ends susceptible to exonuclease attack. These transcripts were initially discovered in plant viroids and later in eukaryotes, but received little attention until the advent of next generation sequencing technologies, which allowed them to be identified in several groups of organisms in the domains of life. Studies have shown that such molecules participate in gene regulation at the transcriptional and post-transcriptional levels, are associated with pathological processes in mammals and are responsive to different types of plant stress. In this work, the in silico identification of circRNAs in Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare, which resulted in the detection of more than 89,000 predicted backsplicing events. From this total, twelve circRNAs satisfying specific criteria were selected for validation, such as having been detected in silico by at least three methods and having binding sites for microRNAs. Among these, nine sequences were confirmed in leaf samples at different stages, through PCR with the use of divergent primers and of these, seven were confirmed by resequencing. Most of the circRNAs tested showed multiple PCR products, indicating the occurrence of alternative circularization of the primary transcript, a process already observed in other works. The conservation of circular transcripts confirmed by re-sequencing was then tested in different tissues of six other species of the genus Oryza. The species O. sativa f. spontanea, O. rufipogon and O. punctata showed amplification of a circRNA in the leaf samples tested. In the root samples, the species O. sativa f. spontanea, O. rufipogon, O. punctata and O. australiensis also showed amplification for at least one of the circRNAs tested. The parental genes of the circRNAs identified initially in O. sativa have homologues in the other species tested, indicating that the amplicons observed in these species are from circRNAs, but some circRNAs exhibited PCR products with sizes different from those expected in O. sativa which must be re-sequenced to have their nature confirmed. The possibility of finding conserved circRNAs among different species of the genus Oryza offers a new potential at molecular level for the study of agronomic useful genetic characteristics, besides to contribute to the understanding of the evolutionary processes of this class of RNA.