Avaliação da resposta de células de adenocarcinoma ductal pancreático PANC-1 à gemcitabina em perfil de tratamento semelhante ao protocolo clínico : foco no papel da autofagia

Abstract

O câncer de pâncreas é a terceira causa de morte por câncer nos Estados Unidos e a sétima no Brasil. Menos de 10% dos pacientes sobrevivem 2 anos livres de doença. Dentre os diversos subtipos o mais comum é o Adenocarcinoma Ductal de Pâncreas (ADP). Apesar dos avanços observados na terapia antitumoral nas últimas décadas, quimioterápicos clássicos como a gemcitabina (GEM) continuam sendo uma alternativa primária para terapia do ADP. Porém, a resistência e recorrência tumorais são frequentes, e são escassos os trabalhos que avaliam a resposta das células de ADP à GEM a longo prazo. Sendo assim, nós utilizamos um racional experimental de tratamento agudo (48h) seguido do crescimento das células tumorais em Meio Livre de Droga por 10 dias (período de recuperação), para mimetizar o período de recuperação dos pacientes. A partir deste modelo nós avaliamos o efeito da GEM na viabilidade fenotípica celular, na clonogenicidade das células tumorais e nos níveis de marcadores de autofagia tanto após o tratamento agudo (48h) quanto após 5 e 10 dias do tratamento. Por fim, avaliamos a relação entre níveis de autofagia e sobrevivência celular durante o período de recuperação. Nós observamos que o tratamento com GEM 10 e 30 M por 48h causou uma redução do número de células com fenótipo viável a longo prazo. Para o tratamento com a dose GEM 1 M observamos redução desta população celular 5 dias após o tratamento, porém esta redução não se acentuou 10 dias após o tratamento. O tratamento com GEM também reduziu a clonogenicidade das células e aumentou indicadores de autofagia a longo prazo (medido pela marcação com laranja de acridina e complexidade intracelular, ambos por citometria de fluxo). Finalmente, observamos que células com fenótipo viável após 5 e 10 dias apresentaram níveis mais intensos de marcação com laranja de acridina, sugerindo que a autofagia atue favorecendo a sobrevivência das células de ADP em resposta à GEM. Concluímos, assim, que as células de ADP ativam autofagia possivelmente como mecanismo de citoproteção à GEM, e que o desenho experimental utilizado possui características que podem mimetizar, ao menos parcialmente, o comportamento de recorrência tumoral observado clinicamente. A modulação racional da autofagia induzida por este quimioterápico poderia, assim, sensibilizar as células de ADP resistentes à GEM.

Pancreatic cancer is the third leading cause of cancer death in the United States and the seventh in Brazil. Less than 10% of patients survive 2 years free of disease. Among the various subtypes of pancreatic câncer, the most common is Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (ADP). Despite the advances observed in antitumor therapy in the last decades, classic chemotherapeutics such as gemcitabine (GEM) remain a primary alternative for ADP therapy. However, tumor resistance and recurrence are frequent, and there are few studies evaluating ADP cell response to GEM in the long term. Thus, we used an experimental rationale for acute treatment (48h) followed by the growth of tumor cells in a drug-free medium for 10 days (recovery period) to mimic the recovery period of the patients. From this model we evaluated the effect of GEM on cell phenotypic viability, tumor cell clonogenicity and autophagy markers levels both after acute treatment (48h) and after 5 and 10 days of treatment. Finally, we evaluated the relationship between levels of autophagy and cell survival during the recovery period. We observed that treatment with GEM for 48 h resulted in a reduction in the number of cells with a viable phenotype in the long term, especially at doses of 10 and 30 μM. For treatment with 1μM GEM, we observed a reduction of this cell population 5d after treatment, but this reduction did not accentuate 10d after treatment. GEM treatment also reduced cell clonogenicity and increased long-term autophagy indicators (measured by acridine orange labeling and intracellular complexity, both assessed by flow cytometry). Finally, we observed that cells with a viable phenotype after 5d and 10d showed increased acridine orange staining in comparison to apoptotic cells, suggesting that autophagy contributes to cell survival. In the present study, we concluded that the experimental design used has characteristics that approximate the behavior of tumor recurrence clinically observed and that the cells of ADP activate autophagy possibly as a mechanism of cytoprotection to GEM. Rational modulation of autophagy induced by this chemotherapeutic could thus sensitize GEM-resistant ADP cells.