Análise ex vivo do potencial antifúngico da molécula plumieridina em Cryptococcus neoformans

Abstract

Criptococose é uma infecção fúngica invasiva causada pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Esta doença afeta aproximadamente 200.000 indivíduos mundialmente. A alta incidência de mortalidade por meningoencefalite criptococócica associada a problemas de toxicidade, resistência e escassez de terapias antifúngicas torna necessária a pesquisa por novos fármacos. Nosso grupo identificou o potencial terapêutico de um iridóide, plumieridina, isolado do extrato aquoso de sementes de Allamanda polyantha (apocinácea). Sendo assim, o objetivo desse estudo é avaliar as atividades biológicas do composto plumieridina contra C. neoformans. Nós propusemos o uso de um modelo prático para avaliar a eficácia desse composto como tratamento para a criptococcose. Nossa estratégia aborda a infecção de camundongos com uma linhagem fluorescente de C. neoformans, seguida de uma análise de órgãos colonizados baseada na fluorescência. Camundongos foram infectados intranasalmente com linhagens fluorescentes de C. neoformans e tratados com plumieridina ou fluconazol durante 14 dias. Os pulmões e o cérebro foram excisados e examinados no equipamento IVIS LUMINA II, para quantificação da fluorescência e determinação de unidades formadoras de colônia (UFC). A análise por imagem demonstrou uma redução da carga fúngica cerebral e pulmonar de camundongos infectados com C. neoformas. Além disso, para identificar possíveis alvos de plumieridina, estudos in silico foram realizados utilizando o servidor pharmMapper. Entre os alvos preditos, três proteínas envolvidas na via das pirimidinas foram identificadas, timidilato-sintase, orotidine-5’-fosfato-descarboxilase e diidroorotato-desidrogenase. As estruturas de timidilatosintase e orotidina-5’-fosfato-descarboxilase de C. neoformans foram modeladas e submetidas à técnica de docking molecular com a molécula plumieridina, para melhor entender os mecanismos de interação com C. neoformans. Plumieridina interage com os aminoácidos no centro catalítico das enzimas. Além disso, o perfil de expressão de genes de C. neoformans relacionados à via das pirimidinas na presença de plumieridina também foi avaliado por PCR em tempo real (RT-qPCR). Uma diminuição significativa nos níveis de transcrição dos genes da timidilato sintase e da orotidine-5’-fosfato-descarboxilase foi detectada quando as células foram cultivadas na presença de plumieridina. Nossos resultados podem contribuir para descrição e desenvolvimento de novos antifúngicos para o tratamento da criptococose.

Cryptococcosis is an invasive fungal infection caused mainly by the pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. This disease affects approximately 200,000 individuals annually worldwide. Currently, antifungal drugs show some limitations related to toxicity and resistance, which emphasizes the importance of search for new drugs. Our group identified the antifungal potential of one iridoid - Plumieridine - isolated from the aqueous extract of Allamanda polyantha (Apocynaceae) seeds. Therefore, the objective of this study is to evaluate the biological activities of plumieridine compound against C. neoformans. We propose the use of a practical model to evaluate the treatment efficacy of this compound against C. neoformans. Our approach involves mice infection with C. neoformans fluorescent strain, followed by fluorescence-based imaging analysis of the colonized organs. Mice were infected intranasally with the fluorescent C. neoformans strain and treated with plumieridine or fluconazole for 14 days. The lung and brain were excised and examined in an IVIS Lumina II instrument to determine fluorescence intensity and for CFU determination. Imaging analysis showed that the treatment with plumieridine reduced the pulmonary and cerebral fungal burden of mice infected with C. neoformans. Moreover, in order to identify a possible target of plumieridine, studies in silico were performed using PharmMapper server. Among the predicted targets, three proteins from the route of pyrimidines were identified, thymidylate synthase, orotidine-5'-phosphate decarboxylase and dihydroorotate dehydrogenase. The structures of thymidylate synthase and orotidine-5'-phosphate decarboxylase were modeled to C.neoformans and docked with plumieridine. We found that plumieridine interact with the amino acids at the catalytic center of the enzymes. Furthermore, the gene expression profile of C. neoformans related to route of pyrimidines in the presence of plumieridine was evaluated by RT-qPCR. A significant decreased in the transcript levels of thymidylate synthase and orotidine-5'-phosphate decarboxylase genes was detected when cells were cultured in the presence of plumieridine. Our results may contribute for description and development of new antifungal compounds for cryptococcosis treatment.