Reposicionamento de fármacos : avaliação pré-clínica do uso da doxazosina no combate a tumores pediátricos e na neuroproteção em um modelo da Doença de Alzheimer

Abstract

O reposicionamento de fármacos é o estudo da utilização de fármacos para outra indicação do que a originalmente aprovada. Este processo apresenta o potencial de identificação rápida de terapia eficaz contra doenças como câncer e Alzheimer (DA). Vários estudos demonstraram o efeito antitumoral da doxazosina, um bloqueador a1- adrenérgico, e os bloqueadores β1-adrenérgicos têm sido associados à neuroproteção em doenças neurodegenerativas. O câncer e a DA têm uma relação inversa em muitos aspectos, com vários fatores que contribuem para a inibição da apoptose e a proliferação celular sendo aumentados nos cânceres, mas diminuídos na DA. O neuroblastoma (NB) é um tumor pediátrico derivado de células da crista neural embrionária, com uma taxa de cura em torno de 40%, apesar do tratamento agressivo. Os hemangiomas infantis (HIs) são os tumores vasculares mais comuns em bebês. A morbidade pode incluir desfiguração e cicatrizes e, em casos mais graves, perda da visão, comprometimento das vias aéreas, insuficiência cardíaca congestiva, e morte. O NB, o HI e a DA apresentam alterações na via de sinalização de EGFR/Akt/GSK-3b e a descoberta de novos fármacos para o tratamento dessas doenças tem se apresentado como um grande desafio. Assim, no presente estudo investigamos o potencial terapêutico da doxazosina como agente antitumoral contra NB e HI, e como agente neuroprotetor contra a DA. Primeiro, analisamos os efeitos do fármaco em células NB humano SH-SY5Y diferenciadas e indiferenciadas com ácido retinóico e em um modelo in vitro de Da, utilizando culturas organotípicas de hipocampo expostas ao peptídeo b-amiloide (Ab). A doxazosina demonstrou efeito antitumoral em células indiferenciadas de NB por meio da indução de apoptose, necrose, parada no ciclo celular e diminuição dos níveis de p-EGFRTyr1048. Em células diferenciadas, a doxazosina foi menos citotóxica e aumentou os níveis de p- EGFRTyr1048, p-AktSer473 e p-GSK-3bSer9. Além disso, o fármaco foi capaz de proteger as fatias do hipocampo da toxicidade do Ab, através da prevenção da ativação da GSK-3b e da hiperfosforilação da Tau. Em relação ao HI, utilizamos a linhagem celular murina EOMA como modelo. O fármaco foi citotóxico para as células EOMA, mas baixas concentrações de doxazosina aumentaram a migração dessas células. O processo de metástase tumoral envolve diversas fases, entre elas a migração celular e a invasão. Para avaliar se este aumento de migração celular tem relevância biológica para a patologia do HI, é necessário avaliar também o potencial de invasão dessas células. Neste estudo, também padronizamos culturas 3D de esferoides tumorais de células EOMA, o que ainda não foi descrito na literatura. Os esferoides tumorais se assemelham mais ao que ocorre com o tumor in vivo em comparação com as culturas 2D. Observamos que a doxazosina foi capaz de reduzir o tamanho do esferoide tumoral. Ainda, apresentamos nesse estudo resultados preliminares do potencial antitumoral da doxazosina em células WEHI-3B, que são representativas de leucemia mielomonocítica (LMM). A doxazosina foi capaz de induzir a morte das células WEHI-3B após 48h de tratamento. Desse modo, na presente tese demonstramos que a doxazosina apresenta potencial terapêutico não só para tumores como NB, HI e LMM, como também é neuroprotetora em um modelo in vitro da DA. Os nossos estudos estão baseados no reposicionamento da doxazosina para doenças de difícil tratamento, como NB de alto risco e DA, assim como uma doença negligenciada na literatura, como o HI.

Drug repurposing is the study of the identification of novel indications for existing compounds. This process holds the potential of rapid identification of effective therapeutics against diseases such as cancer and Alzheimer’s (AD). Several studies have demonstrated the antitumor effect of doxazosin, an alpha-adrenergic blocker, and β1-adrenergic blockers have been associated with neuroprotection in neurodegenerative diseases. Cancer and AD have an inverse relationship in many respects, with several factors contributing to inhibition of apoptosis and cell proliferation being increased in cancers but decreased in AD. Neuroblastoma (NB) is a pediatric tumor derived from embryonic neural crest cells, with a cure rate of about 40%, despite aggressive treatment. Infantile hemangiomas (IHs) are the most common vascular tumors in infants. Morbidity may include disfigurement and scarring and, in more severe cases, loss of vision, impairment of the airways, congestive heart failure and death. NB, IH and DA present alterations in the EGFR/Akt/GSK-3b signaling pathway and the discovery of new drugs for the treatment of these diseases has presented itself as a major challenge. Thus, in the present study we investigated the therapeutic potential of doxazosin as an antitumor agent against NB and IH, and as a neuroprotective agent against AD. First, we examined the effects of the drug on undifferentiated and retinoic-acid differentiated human SH-SY5Y NB cells, and on an in vitro model of organotypic hippocampal cultures exposed to b-amyloid peptide (Ab). Doxazosin demonstrated an antitumor effect in undifferentiated NB cells through induction of apoptosis, necrosis, cell cycle arrest and decreased levels of p-EGFRTyr1048. On differentiated cells, doxazosin was less cytotoxic and increased levels of p- EGFRTyr1048, p-AktSer473 and p-GSK-3bSer9. In addition, the drug was able to protect the hippocampal slices from Ab toxicity by preventing the activation of GSK-3α and of Tau hyperphosphorylation. Regarding IH, we used the EOMA murine cell line as a model. The drug was cytotoxic to EOMA cells, but low concentrations of doxazosin increased the migration of these cells. The process of tumor metastasis involves several phases, with cell migration and invasion among them. To assess whether this increase in cell migration has biological relevance for IH pathology, it is also necessary to evaluate the potential of these cells for invasion. In this study, we also standardized 3D cultures of tumor spheroids from EOMA cells, which has not yet been described in the literature. Tumor spheroids resemble more closely the tumor in vivo compared to 2D cultures. We observed that doxazosin was able to reduce the size of the tumor spheroid. Furthermore, we present preliminary results of the antitumor potential of doxazosin on WEHI-3B cells, which are representative of myelomonocytic leukemia (MML). Doxazosin was able to induce death of WEHI-3B cells after 48 hours of treatment. Thus, in the present thesis we demonstrated that doxazosin presents therapeutic potential not only for tumors such as NB, IH and MML, but it is also neuroprotective on an in vitro model of AD. Our studies are based on the repurposing of doxazosin for difficult-to-treat diseases such as high-risk NB and AD, as well as a neglected disease in the literature, such as IH.