Efeitos dos principais ácidos graxos acumulados na deficiência da desidrogenase de acilas-CoA de cadeia muito longa sobre importantes funções mitocondriais em coração, fígado e músculo esquelético

Abstract

As doenças de oxidação mitocondrial de ácidos graxos são patologias genéticas reconhecidas como importantes causas de morbidade e mortalidade na população infanto-juvenil. Uma das mais comuns é a deficiência da desidrogenase de acilas- CoA de cadeia muito longa (VLCAD). Essa doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e de seus conjugados de carnitina nos tecidos e líquidos biológicos dos pacientes afetados e, clinicamente, por disfunção cardíaca, hepática e muscular. Os ácidos cis-5-tetradecenoico (Cis-5) e mirístico (Myr) são os que mais se acumulam nessa doença, sendo que o primeiro é o marcador bioquímico. As disfunções cardíaca e hepática, que podem levar os pacientes à morte, bem como os recorrentes episódios de rabdomiólise ainda não possuem sua fisiopatologia esclarecida. A presente investigação objetivou estudar os efeitos desses metabólitos acumulados sobre parâmetros importantes da função mitocondrial (parâmetros respiratórios, potencial de membrana (ΔΨm), conteúdo de NAD(P)H, inchamento mitocondrial, capacidade de retenção de Ca2+, liberação de citocromo c, produção de ATP, atividades dos complexos da cadeia respiratória e enzimas do ciclo do ácido cítrico) em mitocôndrias isoladas de coração, fígado e músculo esquelético de ratos jovens, bem como em fibras permeabilizadas de coração e de músculo esquelético e células hepáticas e cardíacas cultivadas. Verificamos que o Cis-5 e o Myr, em concentrações patológicas, reduziram significativamente os estados 3 e desacoplado da respiração celular, a produção de ATP, o ΔΨm e a capacidade de retenção de Ca2+ nos três tecidos testados, bem como o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial no coração, e a atividade do complexo I no coração, do complexo I-III no fígado e músculo esquelético e da enzima α-cetoglutarato desidrogenase no fígado. Estes ácidos graxos também aumentaram o estado 4 da respiração celular (efeito desacoplador) em todos os tecidos testados, com o envolvimento do translocador de nucleotídeos de adenina em coração e fígado, pois o carboxiatractilosídeo atenuou significantemente o aumento do estado 4 provocado pelos Cis-5 e Myr. Além disso, o Cis-5 e o Myr induziram inchamento mitocondrial e a liberação de citocromo c no fígado. Observamos ainda que os inibidores clássicos da formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) ciclosporina A mais ADP, bem como o inibidor da captação de Ca2+ rutênio vermelho preveniram completamente a diminuição do ΔΨm mitocondrial em todos os tecidos testados, bem como a indução do inchamento mitocondrial em fígado, provocados pelo Myr e Cis-5 na presença de Ca2+, sugerindo, respectivamente, que a indução da abertura do poro de MTP e a contribuição do Ca2+ estão envolvidas nesses efeitos. Os efeitos observados na respiração celular obtidos em mitocôndrias isoladas se confirmaram em preparações in situ de células cultivadas (cardiomiócitos e hepatócitos) e em fibras musculares cardíacas e esqueléticas, reforçando os efeitos deletérios desses ácidos graxos. Não foram observadas alterações na homeostase redox avaliados através do conteúdo de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico e glutationa reduzida em coração. Os achados no presente trabalho indicam que, em concentrações patológicas, os ácidos graxos de cadeia longa que mais se acumulam na deficiência da VLCAD prejudicam a bioenergética mitocondrial e a homeostase do Ca2+, atuando como desacopladores e inibidores metabólicos da fosforilação oxidativa, além de serem indutores da abertura do poro de MPT em coração, fígado e músculo esquelético. Assim, presumimos que o comprometimento na bioenergética e na homeostase do Ca2+ possam contribuir para as manifestações cardíacas, hepáticas e musculares observadas na deficiência da VLCAD.

The genetic fatty acid oxidation disorders are genetic pathologies recognized as important causes of morbidity and mortality in child-juvenile population. One of the most common is very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) deficiency. This disease is biochemically characterized by accumulation of fatty acids and their correspondent carnitine derivatives in tissues and biological fluids from affected patients, and clinically by cardiac, hepatic and muscular dysfunction. Cis-5- tetradecenoic (Cis-5) and myristic (Myr) acids are those that most accumulate in this disorder, wherein the first one is the biochemical hallmark. The cardiac and hepatic dysfunction, which may lead the patients to death, as well as the recurrent rhabdomyolysis episodes have the pathogenesis still poorly unknown. The present investigation was aimed to study the effects of these accumulated metabolites on important mitochondrial function parameters (respiratory parameters, membrane potential (ΔΨm), NAD(P)H content, mitochondrial swelling, Ca2+ retention capacity, cytochrome c release, ATP production, respiratory chain complexes and citric acid cycle enzymes activities) in isolated mitochondria of heart, liver and skeletal muscle from young rats, as well as in permeabilized heart and skeletal muscle fibers and hepatic and cardiac cultivated cells. We verified that Cis-5 and Myr, at pathological concentrations, strongly reduced states 3 and uncoupled of respiration, ATP production, ΔΨm and Ca2+ retention capacity in all tested tissues, as well as matrix mitochondrial NAD(P)H content in heart, complex I activity in heart, complex I-III in liver and skeletal muscle and α-ketoglutarate dehydrogenase activity in liver. Also, these fatty acids increased state 4 respiration (uncoupling effect) in all tested tissues, with the involvement of the adenine nucleotide translocator in heart and liver since carboxyatractyloside significantly attenuated the increased state 4 respiration provoked by Cis-5 and Myr. In addition, Cis-5 and Myr caused mitochondrial swelling and cytochrome c release in liver. We also observed that the classical inhibitors of mitochondrial permeability transition (MPT) pore cyclosporin A plus ADP, as well as the Ca2+ uptake blocker ruthenium red, fully prevented the decrease of ΔΨm in all tested tissues as well as mitochondrial swelling induction in liver provoked by Myr and Cis-5 in Ca2+-loaded mitochondria, suggesting, respectively, induction of MPT pore opening and the contribution of Ca2+ in these effects. The effects observed in cellular respiration obtained in isolated mitochondria were confirmed in in situ cell preparations (cardiomyocytes and hepatocytes), as well as in cardiac and skeletal muscle fibers, reinforcing the deleterious effects of the fatty acids. In contrast, there were no alterations of redox homeostasis evaluated by the content of thiobarbituric acid reative species and reduced glutathione in heart. The present findings indicate that the major long-chain fatty acids that accumulate in VLCAD deficiency disrupt mitochondrial bioenergetics and Ca2+ homeostasis, acting as uncouplers and metabolic inhibitors of oxidative phosphorylation, as well as inducers of MPT pore opening in the heart, liver and skeletal muscle at pathological relevant concentrations. It is therefore presumed that disturbance of bioenergetics and Ca2+ homeostasis may contribute to the cardiac, hepatic and muscular manifestations observed in VLCAD deficiency.