Efeitos do betabloqueador Bucindolol nos tecidos pulmonar e cardíaco expostos à ativação sustentada do sistema nervoso simpático

Abstract

Objetivos: Verificar o papel do bucindolol, um bloqueador adrenérgico β1, β2 e α1 e agente simpatolítico, sobre a disfunção endotelial e remodelamento vascular pulmonar em ratos Wistar com Hipertensão Arterial Pulmonar (HAP) (estudo in vivo), bem como sobre vias de sinalização para hipertrofia/sobrevivência e morte celular em células cardíacas H9c2 expostas à noradrenalina (estudo in vitro). Materiais e Métodos: No estudo in vivo, os animais foram divididos nos grupos: controle (CTR), monocrotalina (MCT), controle+bucindolol (CTR+BCD) e monocrotalina+bucindolol (MCT+BCD). A HAP foi induzida através de uma única injeção intraperitoneal (i.p.) de monocrotalina (60 mg/kg). Após duas semanas, os animais foram tratados por sete dias com bucindolol (2 mg/kg/dia – i.p.) ou veículo. Ao final do tratamento, os animais foram submetidos à ecocardiografia para avaliação da resistência vascular pulmonar (RVP) e índice de performance do miocárdio (IPM). Os pulmões foram coletados para análise do estresse oxidativo e análises por western blot. As artérias pulmonares foram coletadas para as análises histológicas e de imunohistoquímica. No estudo in vitro, os seguintes grupos foram estabelecidos: controle (CTL), noradrenalina (NE), controle+bucindolol (CTL+BCD) e noradrenalina+bucindolol (NE+BCD), onde as células H9c2 foram incubadas com noradrenalina (10 μM por 24 h) na presença ou ausência de bucindolol (10 μM por 8 h). O western blot foi utilizado para determinar a expressão das proteínas de hipertrofia/sobrevivência, de morte celular (autofagia e apoptose) e para estimar a lipoperoxidação (4-HNE). A citometria de fluxo foi utilizada para mensurar a atividade da caspase-3/7 e as espécies reativas de oxigênio (EROs). Resultados: 6 No estudo in vivo, o grupo MCT+BCD demonstrou menor (32%) expressão do receptor de endotelina-1 A (ETAR) e da razão ETAR / ETBR (62%) quando comparado com o grupo MCT. O tratamento com bucindolol não alterou o estresse oxidativo, determinado pela expressão/atividade das enzimas antioxidantes e lipoperoxidação, e a expressão da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e diminuiu os níveis de nitrotirosina em homogeneizados de pulmão. O bucindolol foi capaz de melhorar o remodelamento da vasculatura pulmonar no grupo MCT+BCD, reduzindo a RVP (21%) e o IPM em relação ao grupo MCT. No estudo in vitro, o grupo NE+BCD apresentou redução na sinalização para hipertrofia, observada através da inferior expressão/atividade de proteínas como o transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3), a fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e a p70 S6 kinase (p70 S6K), quando comparado com o grupo NE. O tratamento com bucindolol promoveu o aumento da autofagia, evidenciado pelo aumento da razão da proteína associada ao microtúbulo de cadeia leve 3 (LC3-II) / LC3-I. O grupo NE+BCD apresentou redução na apoptose em relação ao grupo NE, observada pela diminuição da ativação da caspase 3/7. O bucindolol também foi eficaz em reduzir as EROs e a lipoperoxidação no grupo NE+BCD quando comparado ao grupo NE. Conclusão: O bucindolol foi capaz de atenuar o remodelamento vascular pulmonar através da redução do ETAR e, consequentemente, reduzir a RVP e o IPM em animais com HAP. Além disso, este betabloqueador foi capaz de reduzir a sinalização para hipertrofia e apoptose nas células H9c2, possivelmente por redução do estresse oxidativo. Em resumo, o papel protetor do bucindolol foi demonstrado em ambos experimentos, in vivo e in vitro, em resposta à hiperativação simpática, seja por HAP ou por exposição direta à noradrenalina.

Aim: To verify the role of bucindolol, a β1-, β2- and α1-blocker and sympatholytic agent, on endothelial dysfunction and pulmonary vascular remodeling in Wistar rats with PAH (in vivo study), as well as signaling pathways for hypertrophy/survival and cell death in H9c2 cardiac cells exposed to norepinephrine (in vitro study). Materials and Methods: In the in vivo study, the animals were divided into the following groups: control (CTR), monocrotaline (MCT), control+bucindolol (CTR+BCD), and monocrotaline+bucindolol (MCT+BCD). PAH was induced by a single intraperitoneal (i.p.) injection of monocrotaline (60 mg/kg). After two weeks, animals were treated for seven days with bucindolol (2 mg/kg/day - i.p.) or vehicle. At the end of the treatment, animals were submitted to echocardiographic assessment for evaluation of pulmonary vascular resistance (PVR) and myocardial performance index (MPI). The lungs were collected for analysis of oxidative stress and western blot. Pulmonary arteries were collected for histological and immunohistochemical analyzes. In the in vitro study, the following groups were established: control (CTL), norepinephrine (NE), control+bucindolol (CTL+BCD), and norepinephrine+bucindolol (NE+BCD), where H9c2 cells were incubated with norepinephrine (10 μM for 24 h) in the presence or absence of bucindolol (10 μM for 8 h). Western blot was used to determine the expression of hypertrophic/survival proteins, cell death (autophagy and apoptosis) and to estimate lipoperoxidation (4-HNE). Flow cytometry was used to measure the activity of caspase-3/7 and reactive oxygen species (ROS). Results: In the in vivo study, the MCT+BCD group showed lower (32%) endothelin-1 A receptor (ETAR) and ETAR/ETBR ratio (62%) when compared to the MCT group. Treatment with bucindolol did not alter oxidative stress, as determined by the 8 expression/activity of antioxidant enzymes and lipoperoxidation, and the expression of the enzyme endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and decreased levels of nitrotyrosine in lung homogenates. Bucindolol was able to improve pulmonary vasculature remodeling in the MCT+BCD group, reducing PVR (21%) and MPI in relation to the MCT group. In the in vitro study, the NE+BCD group showed reduced signaling for hypertrophy, evidenced through the lower expression/activity of proteins, such as the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), and p70 S6 kinase (p70 S6K) when compared to the NE group. Treatment with bucindolol promoted increased autophagy, evidenced by increased expression of the protein associated with the microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3-II) / LC3-I ratio. The NE+BCD group presented reduction in apoptosis in relation to the NE group, observed by the decrease of the caspase 3/7 activation. Bucindolol was also effective in reducing ROS and lipoperoxidation in the NE+BCD group, when compared to the NE group. Conclusion: Bucindolol was able to attenuate pulmonary vascular remodeling by reducing the ETAR and, consequently, reducing PVR and MPI in animals with PAH. In addition, this beta-blocker was able to decrease the signaling for hypertrophy and apoptosis in H9c2 cells, probably by reducing oxidative stress. In summary, the protective role of bucindolol was demonstrated both in vivo and in vitro experiments, in response to sympathetic hyperactivation by PAH or by direct exposure to norepinephrine.